1. Вуглеводи та ліпіди: властивості та кількісне визначення

Скачати 0.53 Mb.

Назва	1. Вуглеводи та ліпіди: властивості та кількісне визначення
Сторінка	6/7
Дата	05.04.2013
Розмір	0.53 Mb.
Тип	Документи

bibl.com.ua > Фізика > Документи

1 2 3 4 5 6 7

Принцип методу грунтується на різному забарвленні розчину крохмалю йодом, яке залежить від ступеня його гідролізу амілазою при різних значеннях температури і рН середовища.

Хід роботи. В чотири пробірки наливають по 5 мл 0,1%-го розчину крохмалю. Пробірки витримують по 10 хв. при відповідних температурах: першу і четверту – при 20°С, другу – при 0°С, третю – при 37°С. Потім у першу, другу і третю пробірки додають по 1 мл солоду, а в четверту – 1 мл цього ж розчину солоду, але прокип’яченого. Витримують пробірки протягом 30 хв. при цих же температурах і потім додають по 1–2 краплини 1,0%-го розчину йоду в йодиді калію. Забарвлення розчинів у пробірках порівнюють і роблять висновки про вплив температури на дію ферментів.

У три пробірки з 1 мл розбавленої слини чи розчину солоду наливають: в першу – 1 мл 1,0 н. розчину соляної кислоти і 5 мл 0,1%-го розчину крохмалю, в другу – 5 мл 0,1%-го розчину крохмалю, в третю – 1 мл 1,0 н. гідроксиду натрію і 5 мл 0,1%-го розчину крохмалю. Після витримки пробірок при 37°С протягом 30 хв. у них додають, при помішуванні, по 5 краплин розчину йоду в йодиді калію. Порівнюють забарвлення розчинів у пробірках. У пробірках з кислотою і лугом амілаза буде інактивована, і забарвлення розчину не зміниться.

Реактиви: 1. 0,1%-й розчин крохмалю; 2. Розчин солоду або розбавленої водою слини (1:20); 3. 1,0%-й розчин йоду в йодиді калію; 4. 0,1%-й розчин крохмалю в 0,1%-му розчині хлористого натрію; 5. 1.0 н. розчин соляної кислоти; 6. 1,0 н. розчин гідроксиду натрію.
5.3. Вплив активаторів та інгібіторів на активність амілази.

Принцип методу. Активатором амілази є хлорид натрію, а інгібітором – сульфат міді. Ступінь гідролізу крохмалю під впливом амілази буде різним в присутності цих речовин.

Хід роботи. Готують розчин слини; відміряють циліндром 50 1 л дистильованої води і полощуть нею рот протягом 3–5 хвилин у кілька прийомів. Одержану рідину фільтрують через вату і фільтрат використовують. Беруть три пробірки. В першу наливають 2,5 мл води, в другу – 2 мл води і 0,5мл 1%-го розчину хлориду натрію, в третю – 2 мл води і 0,5 мл 1%-го розчину сульфату міді. У всі пробірки вносять по 2,5 мл розчину слини і додають по 2,5 мл 0,5% розчину крохмалю; знову перемішують і ставлять у термостат при температурі 38°С. Через 5 хвилин пробірки виймають і перевіряють ступінь гідролізу крохмалю, додаючи у всі пробірки по 5 крапель розчину йоду. Рідина у першій пробірці забарвлюється у фіолетовий або червоний колір, у другій – у червоний або жовтий, в третій – у синій. Результати свідчать про те, що найкраще гідроліз крохмалю проходить у другій пробірці (хлорид натрію – активатор амілази), а найгірше – у третій (сульфат міді – інгібітор амілази).

Реактиви: 1. Розчин слини (готують студенти перед роботою); 2. 0,5%-й розчин крохмалю; 3. 0,1%-й розчин йоду в 0,2%-му розчині йодиду калію; 4. 1%-й розчин NaCl; 5. 1%-й розчин CuSO₄.
5.4. Якісне визначення β-фруктофуранозидази.

Фермент β–фруктофуранозидаза (інвертаза, сахараза) належить до класу гідролаз. Він каталізує гідролітичне розтоплення вуглеводів, які містять фруктозу у –формі, розщеплюючи β–фруктозидний зв’язок (сахарозу, рафінозу).

Гідроліз сахарози супроводжується утворенням α–глюкози і β–фруктози. Цей фермент має значне поширення в природі, особливо активний він у дріжджах. Інвертаза знаходить застосування в кондитерській промисловості, оскільки утворений під її дією інверсний цукор перешкоджає кристалізації сахарози в кондитерських виробах.

Принцип методу. Наявність β-фруктозидази визначають за редукуючим цукром, який утворюється під час ферментативного гідролізу сахарози. Альдегідна група редукуючого цукру реагує з гідроксидом міді Cu(OH)₂. Редукуючі цукри при цьому окислюються у відповідні кислоти, а голубий гідрат окису міді відновлюється в жовтий гідрат закису міді СuОН .

Фруктоза в розчині Фелінга переходить в альдозу під дією лугу та окислюється в кислоту, яка містить на один атом вуглецю менше, ніж вихідний цукор.

Реакцію відновлення міді та окислення альдегідної групи цукру можна подати таким чином, що альдегідна група редукуючого цукру окислюється в кислоту: R–COH + O  R–COOH за рахунок кисню гідрату окису міді

2Cu(OH)₂  2CuOH + O + H₂O

При нагріванні: 2CuOH  H₂O + Cu₂O

Хід роботи. 5 г свіжих пресованих дріжджів вміщують у фарфорову ступку, куди додають 3 г добре промитого дрібного піску. Потім додають 2 мл води і розтирають протягом 5 хв. У розтерту масу в кілька прийомів приливають, при ретельному перемішуванні, ще 10 мл дистильованої води. Суміш залишають стояти протягом 20 хв. у термостаті при 25–30°С і час від часу струшують. Суміш центрифугують, центрифугат іноді дає опалесценцію, що пояснюється вмістом у ньому деякої кількості глікогену.

В дві пробірки наливають по 5 мл розчину сахарози в буфері. Потім швидко приливають по 1 мл центрифугату екстракту інвертази: в одну пробірку – накип'яченого, в другу – попередньо прокип'яченого протягом 5 хв. і охолодженого. Суміші ставлять на 30 хв. у термостат при 40°С. Після вказаного терміну інкубації приливають по 2 мл фелінгового розчину (по 1 мл розчинів І і ІІ). Рідину в пробірках кип'ятять. Там, де був доданий кип'ячений центрифугат, осад закису міді майже не випадає. В окремих випадках може спостерігатися незначний червоний наліт на дні пробірки: це пояснюється тим, що розчин сахарози містить деяку кількість редукуючих цукрів, або тим, що в ферментному екстракті можуть також міститися редукуючі речовини. В другій пробірці, де фермент активний, випадає значний червоний осад закису міді, який свідчить про ферментативне розщеплення сахарози.

Паралельно рекомендують поставити ще один дослід на специфічність інвертази. В третю пробірку наливають як субстрат не тростинний цукор, а 5 мл 1%-го розчину крохмалю у воді і додають 1 мл некип'яченого центрифугату. Суміш інкубують у термостаті при температурі 40°С. Потім додають 2 мл фелінгової рідини, по 1 мл розчинів І і ІІ, кип'ятять і спостерігають за процесом. У цьому випадку осаду закису міді не буде, що вказує на специфічну дію сахарози.

Реактиви: 1. Розчин тростинного цукру в буфері (рН 4,5): В колбу місткістю 1 л наливають 50 мл нормального розчину оцтовокислого натрію та 50 мл нормального розчину оцтової кислоти і доводять водою до мітки. В мірній колбі місткістю 1 л розчиняють буферною сумішшю 100 г тростинного цукру і доводять вміст колби цією ж сумішшю до мітки. Розчин зберігають на холоді (2–4°С) або консервують толуолом, додаючи його близько 1 мл; 2. Реактив Фелінга: Розчин І. 40 г перекристалізованої сірчанокислої міді розчиняють у мірній колбі місткістю 1 л і доводять водою до мітки. Розчин П. 200 г сегнетової солі (подвійна сіль калію) і натрію винної кислоти KNaC₄H₄O₆4H₂O і 150 г хімічно чистого їдкого натру розчиняють у мірній колбі місткістю 1 л і доводять водою до мітки. Розчини І і П при проведенні реакції приливають в однакових кількостях; 3. 1,0%-й розчин крохмалю у воді.
5.5. Визначення амілолітичної активності.

Амілази каталізують гідроліз високомолекулярних полісахаридів крохмалю і глікогену. Найважливішим джерелом амілаз є злакові, які містять їх як у непророщеному, так і (особливо багато) в пророщеному зерні. В останньому випадку амілази мають високу активність.

Широке застосування амілази знаходять у крохмало–патоковому, спиртовому, пивоварному і хлібопекарному виробництвах як головні ферменти, що каталізують процеси розщеплення крохмалю й утворення бродильного цукру.

Амілолітична активність характеризує здатність ферментів каталізувати гідроліз крохмалю до декстринів, які не забарвлюються йодом. Метод характеризує активність α-амілази, але при наявності в препараті β-амілази і глюкоамілази цим методом визначають сумарну дію всіх амілолітичних ферментів.

За одиницю амілолітичної активності прийнято таку кількість ферменту, яка каталізує розщеплення 1 г розчинного крохмалю до декстринів, які не забарвлюються йодом за 1 год при 30°С у чітко визначених умовах.

Амілолітичну здатність препарату (АЗ) виражають числом указаних одиниць в 1 г сухого препарату чи в 1 мл розчину. При такому способі вираження АЗ безпосередньо показує, скільки грамів крохмалю може бути прогідролізовано до нездатних забарвлюватися йодом декстринів 1 г препарату, культури чи 1 мл розчину за 1 год (в умовах, аналогічних умовам визначення).

Принцип методу грунтується на гідролізі 1,0%-го буферного розчину крохмалю. Кінець реакції контролюється візуально за йодною пробою. За часом, протягом якого проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, визначається амілолітична активність препарату,

Хід роботи. В конічну колбу на 50–100 мл вносять піпеткою 20 мл 1,0%-го розчину крохмалю і поміщають у термостат з температурою 30°С. Загальний об'єм реакційної суміші завжди повинен бути рівний 30 мл, і якщо на аналіз беруть менше 10 мл ферментного розчину, об’єм, кого нестає доповнюість дистильованою водою, яку приливають перед додаванням ферментного розчину.

Через 10 хв витримки в термостаті в колбу вносять ферментний розчин при ретельному перемішуванні і точно за секундоміром відмічають час.

За початок реакції приймають час, коли з піпетки виллється половина вмісту. Через кожну хвилину після початку реакції або частіше скляною паличкою відбирають краплину суміші і на білій порцеляновій пластинці з'єднують її з раніше нанесеною краплиною робочого розчину йоду.

Реакція розщеплення крохмалю вважається закінченою, коли йод перестане змінювати забарвлення на синє при з’єднанні з краплиною дослідної рідини (протягом перших 10 с).

Час, за який проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, може становити від 3 до 20 хв., але більш надійні результати отримують у межах від 5 до 15 хв. Всі піпетки, які використовуються при аналізі, повинні мати ватні тампони (для запобігання попадання слідів слини).

Примітка. Якщо час зникнення забарвлення менше 3 хв., то визначення повторюють з меншою кількістю розчину ферменту, наприклад – 2 мл. У цьому випадку в пробірку чи колбу з 20 мл крохмалю вносять 3 мл дистильованої води. Під час аналізу дуже активних препаратів концентрації розчинів роблять меншими (0,1г в 200 або 500 мл).

Якщо час зникнення забарвлення становить більше 20 хв., то готують розчин ферменту більшої концентрації, наприклад, 1:50 чи 1:100, а рідину можна нерозбавляти зовсім.

При часі зникнення забарвлення в межах 3–5 хв. проби відбирають кожні 15 с; 5–10 хв. – кожні 30 с; а більше 10 хв. – кожну хвилину.

Скляну паличку після кожної проби промивають дистильованою водою і витирають чистим некрохмаленим рушником.

Розрахунок амілолітичної активності (амілолітичної здатності – А3)

Розрахунок АЗ проводиться за формулою:

де 0,2 – кількість крохмалю в реакційній суміші, г; 60 – коефіцієнт перерахунку на 1 год; а – кількість ферментного препарату, введеного в реакційну суміш у грамах абсолютно сухої речовини або мілілітрах рідинного об'єкта; t – час, за який пройшло розщеплення крохмалю до нездатних забарвлюватися йодом продуктів, хв; 1 – перерахунок на 1 г абсолютно сухого препарату або 1 мл розчину.

Приклад розрахунку. Для аналізу беруть 5 мл ферментного розчину з розбавленням 1:2000, що відповідає 0,0026 г препарату

.

Забарвлення з йодом зникає через 6,5 хв., тоді за формулою:

Реактиви: 1. 1,0%-й розчин розчинного крохмалю (картопляного). Наважку беруть з такого розрахунку, щоб в 100 мл розчину був 1 г сухого крохмалю. Наважку крохмалю кількісно переносять у велику склянку з киплячою водою, кип’ятять 2 хв. й охолоджують, весь час перемішуючи розчин скляною паличкою. Охолоджений крохмаль переносять у мірну колбу того об’єму, з розрахунку на який взята наважка крохмалю, додають буферний розчин (2) в кількості 10 мл на 100 мл розчину і доводять до мітки дистильованою водою. Розчин крохмалю готують у день аналізу; 2. буферний розчин: змішують рівні об’єми нормальних розчинів оцтової кислоти (58 мл льодяної оцтової кислоти в 1 л дистильованої води (оцтовокислого натрію) 82 г СH₃СООNа або 136 г CH₃COONa3H₂О в 1 л води), рН = 4,7; 3. Робочий розчин йоду (1,4 г кристалічного йоду і 4,4 г йодистого калію розчиняють у малому об’ємі води, та об’єм розчину доводять до 100 мл., зберігають у темному місці); 4. робочий розчин йоду готують в день аналізу (20 мл основного розчину йоду доводять дистильованою водою до 100 мл і на кожні 100 мл робочого розчину додають 4 г йодистого калію); 5. розчин ферменту: а) Для технічного ферментного препарату (культура гриба) із ретельно подрібненої абсолютно сухої середньої проби беруть у колбу на 200–300 мл наважку 1 г (з точністю до 0,01), додають піпеткою 50–100 мл дистильованої води і настоюють протягом 1 год. при кімнатній температурі, перемішуючи через кожні 10 хв.; по закінченні 1 год. розчин фільтрують через складчастий фільтр; б) Для очищених ферментних препаратів: на аналітичних вагах беруть наважку середньої проби тонко подрібненого препарату в 0,1 г. Препарат ретельно розтирають скляною паличкою в невеликій кількості води, потім переносять в мірну колбу на 100 мл і доводять дистильованою водою до риски; розчин фільтрують.

5.6. Визначення протеолітичної активності.

Важливим етапом технології багатьох харчових виробництв в біохімічні перетворення білків, які відбуваються під дією протеолітичних ферментів. В основі визначення протеолітичної активності лежать різні принципи: зміна фізико-хімічних властивостей субстратів, визначення зменшення субстрату, облік кількості продуктів протеолізу.

Контроль за зменшенням субстрату дозволяє судити про активність протеїназ, оскільки при цьому визначається кількість непрогідролізованого білка. Тому метод можна використовувати для препаратів, які застосовуються в різних галузях промисловості.

Принцип методу полягає в гідролізі казеїну відомою кількістю ферментного препарату і визначенні ступеня розщеплення білка за зменшенням кількості соляної кислоти, що зв'язується непрогідролізованим казеїном. Після ферментної дії протягом 1 год. у досліді і перед доданням такої ж кількості ферментного екстракту в контролі ферментативну реакцію зупиняють 0,1 н. розчином соляної кислоти. Осади фільтрують, а 10 мл фільтрату титрують 0,1 н. розчином NaOH. Кількість NaOH, що пішла на титрування в дослідній та контрольній пробах, береться за міру протеолітичної активності об'єкта, що піддають аналізу.

Цей метод є досить простим і зручним у роботі. За одиницю активності прийнята кількість ферменту, яка за 1 год. при 30°С каталізує гідроліз 1 г казеїну.

Хід роботи. У колби (плоскодонні чи конічні) на 100 мл набирають піпеткою по 20 мл розчину казеїну і занурюють у водяну баню з температурою 30С. Через 10 хв. в них наливають при помішуванні 10 мл ферментного розчину. Весь об'єм (казеїн і ферментний розчин) повинен бути 30 мл. Якщо на аналіз береться менше 10 мл ферментного розчину, недостатній до 30 мл об'єм заповнюється дистильованою водою, яку приливають перед введенням ферменту. Рівно через годину в колби приливають (теж при помішуванні) піпеткою 20 мл 0,1 н. розчину соляної кислоти в 7,5%-му сульфаті натрію та фільтрують до повної прозорості (повертаючи фільтрат на той самий фільтр). Контроль (два паралельні визначення) ставлять таким самим чином: до введення ферментного розчину додають суміш соляної кислоти з 7,5% сульфатом натрію і колби не витримують на водяній бані, а відразу фільтрують. У 20 мл фільтрату контролю та досліду відтитровують надлишок соляної кислоти 0,1 н. розчином гідроксиду натрію. Титрують у присутності двох краплин 0,5%-го спиртового розчину крезолроту до червоного забарвлення. Різниця титрувань (дослід – контроль), перерахована на 10 мл фільтрату, може становити 0,4–2,5 мл. Якщо вона менша за 0,4 чи більша 2,5 мл, то аналіз повторюють з більшою чи меншою дозою ферменту, змінюючи кількість ферментного розчину або його розбавлення.

1 2 3 4 5 6 7

Схожі:

Конспект заняття з біології на тему: «Будова, властивості, роль в життєдіяльності полісахаридів» Чим складні ліпіди відрізняються від простих? Наведіть приклади простих і складних ліпідів	З КОНТРОЛЮ ЯКОСТІ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ МІНІСТЕРСТВА ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ ЗАТ “Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод, які не відповідають вимогам ФС 42У-4-586-99 за показниками “Ідентифікація” (негативна...
Розглянуто на засіданні циклової Затверджую Визначення інформації і інформатики. Властивості інформації. Одиниці вимірювання інформації	1. Технічне та програмне забезпечення ЕОМ Визначення інформації і інформатики. Властивості інформації. Одиниці вимірювання інформації
Тема Підсумкове заняття. Як визначити якісний продукт (споживча культура) У повсякденному харчуванні обов’язково мають бути: білки, жири, вуглеводи, вітаміни, мінеральні речовини, клітковина, вода	Що потрібно для організму? Роль харчування у житті людини. Білки, жири, вуглеводи. Вітаміни. Мінеральні речовини та мікроелементи. Вода. Практична робота: робота...
УРОК №1 Тема. Початкові поняття геометрії. Властивості точок і прямих Узагальнивши практичні знання і вміння учнів, сформулювати властивості приналежності точок і прямих та властивості взаємного розміщення...	Лабораторнаробота №1 ВИЗНАЧЕННЯ ХЛІБОПЕКАРСЬКИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ПШЕНИЧНОГО... Мета роботи: засвоїти методики і визначити хлібопекарські властивості пшеничного борошна за кількістю і якістю клейковини, газоутворюючою...
УРОК №15 Тема. Узагальнення вивченого матеріалу з теми «Основні геометричні... Про означення, властивості суміжних та вертикальних кутів; а також про означення, ознаки та властивості паралельних прямих; повторити...	Василь КОЖЕЛЯНКО, Буковина України з від'ємного почав перетворюватися на додатній, тобто припинилося кількісне скорочення населення, мало того, воно почало...

Додайте кнопку на своєму сайті:
Портал навчання