1. Вуглеводи та ліпіди: властивості та кількісне визначення

Скачати 0.53 Mb.

Назва	1. Вуглеводи та ліпіди: властивості та кількісне визначення
Сторінка	2/7
Дата	05.04.2013
Розмір	0.53 Mb.
Тип	Документи

bibl.com.ua > Фізика > Документи

1 2 3 4 5 6 7

Існує кілька модифікацій методу формольного титрування, в основі яких лежать наведені реакції.

Хід роботи. У колбу на 25 мл наливають 3 мл 0,25%-го розчину амінокислот (наприклад, гліцину) або гідролізату білка; додають краплину 0,1%-го спиртового розчину фенолфталеїну і краплинами 0,1 н. розчин їдкого натру до почервоніння рідини. У нейтралізований таким чином гліцин доливають 2 мл формольної суміші. При цьому червоне забарвлення розчину зникає. Далі титрують 0,1 н. розчином гідроксиду натрію до появи червоного забарвлення.

Обчислення вмісту азоту амінних груп у досліджуваному матеріалі проводять таким чином: наприклад, на титрування дослідного розчину (3 мл 0,25%–го нейтралізованого розчину гліцину) витратили 0,98 мл 0,1 н. розчину гідроксиду натрію. Знаючи, що 1 мл 0,1 н. розчину гідроксиду натрію відповідає 1,4 мг азоту, обчислюємо кількість амінного азоту в дослідному розчині:

Дослідний розчин містить 7,510^–3 г амінокислоти (0,25% – це 0,25 г у 100 мл, ми взяли 3 мл). Якщо в 7,510^–3 г гліцину міститься 1,3710^–3 г, то в 100 г гліцину буде 18,2 г, або 18,2%. Аналогічно роблять розрахунок вмісту амінного азоту у гідролізаті білка.

3. Властивості білків, методи їх кількісного визначення.
3.1. Ізоелектрична точка білків.

У водному середовищі розчинні білки мають певний заряд. Величина і знак заряду залежать від кількості іонізованих груп амінокислот, що входять до складу даного білка.

Іонізація карбоксильних груп глутамінової та аспарагінової кислот надають білковій молекулі негативного заряду, а іонізація аміногруп лізину та аргініну – позитивного. Більшість білків мають негативний заряд, тобто є кислими білками.

При певному значенні рН середовища ступінь дисоціації карбоксильних та аміногруп урівнюється, і молекула білка стає електронейтральною. Таке значення рН розчину називається ізоелектричною точкою. Для кислих білків значення ізоелектричної точки лежить в області рН менше 7,0 в якій пригнічується дисоціація карбоксильних груп, а при рН більше 7,0 пригнічується дисоціація аміногруп..

Розчини білків в ізоелектричній точці нестійкі і легко випадають в осад.

Лабораторний посуд: пробірки, піпетки.

Матеріали та реактиви: 1. 0,1 н. розчин оцтової кислоти; 2. 0,01 н. розчин оцтової кислоти; 3. 0,5%-й розчин казеїну в 1 н. розчині оцтовокислого натрію.

Принцип методу. Визначення ізоелектричної точки білків грунтується на здатності білків під дією осаджувачів, що викликають дегідратацію білків, при значенні рН середовища, що відповідає їх ізоелектричній точці, легко осаджуватися.

Хід роботи. У вісім пробірок наливають по 1 мл розчину казеїну і додають у певних співвідношеннях розчини оцтової кислоти для утворення різної реакції середовища, згідно з таблицею:

Розчини, мл	Номер пробірки
Розчини, мл	1	2	3	4	5	6	7	8
Розчин казеїну	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
0,01 н розчин CH₃COOH	0,6	1,25						
0,1 н розчин CH₃COOH			0,25	0,50	1,0	2,0	4,0	8,0
Вода	8,4	7,75	8,75	8,5	8,0	7,0	5,0	1,0
Значення рН	5,9	5,6	5,3	5,0	4,7	4,4	4,1	3,8

Пробірки витримують при кімнатній температурі протягом 30 хв. Визначають ізоелектричну точку казеїну за максимальним ступенем помутніння.

3.2. Кількісне визначення білка на основі біуретової реакції.

Серед колориметричних методів, що основані на кольорових реакціях на білки, широкого розповсюдження набув метод кількісного визначення білка за допомогою біуретового реактиву (розчину сульфату міді і сегнетової солі у NаОН певної концентрації).

Мета роботи: засвоєння методу кількісного визначення білка за допомогою біуретової реакції.

Апаратура: фотоелектроколориметр.

Лабораторний посуд: скляні палички, пробірки, піпетки.

Матеріали та реактиви: 1. Біуретовий реактив (1,5 г сульфату міді, 6 г сегнетової солі, 300 мл 10%-го розчину гідроксиду натрію розчиняють в 1 л дистильованої води); 2. 1, 2, 3, 4, 5%-ні розчини яєчного білка; 3. Розчин білка.

Принцип методу. У лужному середовищі в присутності солей міді розчини білків набувають фіолетового забарвлення, яке зумовлене наявністю у молекулі білка пептидних зв’язків, що утворюють у даних умовах мідно-–натрієві солеподібні комплекси. Інтенсивність забарвлення комплексу залежить від кількості пептидних зв'язків, а значить від кількості білка у розчині та від кількості мідної солі. Якщо додавати визначену кількість мідної солі, то ступінь забарвлення буде прямо пропорційною концентрації білка у розчині.

Хід роботи. У п'ять пробірок наливають по 2 мл стандартних розчинів білка різної концентрації, наприклад 1. 2, 3, 4, 5%-ні розчини. У шосту пробірку наливають 2 мл дослідного розчину білка, а в сьому – 2 мл дистильованої води (контроль). Потім у всі пробірки додають по 8 мл біуретового реактиву. Вміст пробірок переміщують і через 30 хв. на фотоелектроколориметрі визначають оптичну густину (D) при червоному світлофільтрі. Як контроль використовують пробу з дистильованою водою.

Результати перших п'яти проб використовують для побудови калібрувального графіка. По осі абсцис відкладають концентрацію стандартних розчинів білка, по осі ординат – відповідні їм значення оптичної густини (D). Одержані точки з'єднують прямою лінією. Визначивши значення оптичної густини дослідного розчину білка, за калібрувальним графіком знаходять його концентрацію.

3.3. Осадження білків.

А. Осадження білків реактивами на алкалоїди

Осадження білків реактивами на алкалоїди – це необоротна реакція. Алкалоїди представляють собою азотисті основи, то містять у молекулі різні гетероцикли з атомами азоту. У білковій молекулі також є деякі гетероцикли, що містять азот, тому для білків характерні деякі реакції, притаманні алкалоїдам.

Лабораторний посуд: пробірки, піпетки.

Матеріали та реактиви: 1. Розчин яєчного білка (1%-й); 2. 10%-й розчин пікринової кислоти; 3. Насичений розчин таніну; 4. 1%-й розчин гексоціано-(ІІ)-ферату калію; 5. 1,0%-й розчин оцтової кислоти.

Принцип методу. Механізм осадження білків алкалоїдними реактивами (таніном, пікринової, гексаціанової, фосфорно-вольфрамової, фосфорно-молібденової, феритової кислотами і їхніми солями) обумовлений утворенням нерозчинних сполук цих реактивів з азотистими групами білка. У таких сполуках алкалоїдні реактиви є аніонами, а білки — катіонами. Для надання молекулі білка позитивного заряду розчин білка підкислюють оцтовою кислотою. У результаті цього позитивно заряджені частки білка легко взаємодіють з негативно зарядженими молекулами осаджувача. Білки, що мають позитивний заряд (протаміни, гістони), добре осаджуються алкалоїдними реактивами в середовищі без попереднього підкислення середовища інкубації.

Хід роботи. У три пробірки вносять по 1 мл розчину яєчного білка, по 0,5 мл розчину оцтової кислоти і по 2-3 краплі: у першу – розчину пікринової кислоти, у другу – насиченого розчину таніну, у третю – розчину гексоціано-(ІІ)-ферату калію. Спостерігається випадання осаду. При додаванні надлишку розчину гексоціано-(ІІ)-ферату калію і розчину таніну осад розчиняється.

Б. Осадження білків концентрованими мінеральними кислотами

Лабораторний посуд: пробірки, піпетки.

Матеріали та реактиви: 1. Розчин яєчного білка (1%-й); 2. Концентровані азотна, сірчана і соляна кислоти.

Принцип методу. Мінеральні кислоти, крім ортофосфорної, осаджують білки в результаті денатурації і дегідратації білкових молекул. У надлишку всі мінеральні кислоти, крім азотної, розчиняють утворений осад внаслідок перезарядження білка.

Хід роботи. В одну з пробірок вносять 3 мл концентрованої азотної кислоти і по стінках пробірки обережно, щоб рідини не перемішувалися, вливають 3 мл розчину яєчного білка. На границі розділу двох рідин утворюється осад у вигляді білкового кільця (проба Гелера). Вміст перемішують, доливають надлишок азотної кислоти і переконуються, що осад не зникає.

В інші дві пробірки вносять по 3 мл розчину яєчного білка й обережно по стінці пробірки вливають в одну 2-3 краплі концентрованої сірчаної кислоти, а в другу – соляної кислоти. Випадає осад. Додають надлишок цих кислот, обережно струшують кожну пробірку і спостерігають розчинення осаду.

В. Осадження білків органічними кислотами

Лабораторний посуд: пробірки, піпетки.

Матеріали та реактиви: 1. Розчин яєчного білка (1%-й); 2. 20%-й розчин сульфосаліцилової кислоти; 3. 10%-й розчин трихлороцтової кислоти.

Принцип методу.

Деякі органічні кислоти осаджують білки в результаті денатурації і дегідратації білкових молекул, а також у результаті утворення комплексних солей білків з кислотами.

Найбільш широко для осадження білків використовують трихлороцтову (ТХО) CCl₃COOH і сульфосаліцилову HSO₄C₆H₅(OH)COOH кислоти. ТХО осаджує тільки білки і не осаджує проміжні продукти розпаду білків та амінокислоти. Сульфосаліцилова кислота осаджує не лише білки, а й високомолекулярні пептони і поліпептиди.
Хід роботи. В дві пробірки вносять по 5 мл розчину яєчного білка. В одну додають 1 мл розчину трихлороцтової кислоти, в іншу – 1 мл розчину сульфосаліцилової кислоти. В обох випадках спостерігається випадання осаду білка.

Г. Осадження білків при кип’ятінні.

Апаратура: водяна баня, газовий пальник.

Лабораторний посуд: пробірки, піпетки, скляні палички.

Матеріали та реактиви: 1. Розчин яєчного білка (1%-й), 2. 1,0%–й розчин оцтової кислоти; насичений розчин хлориду натрію, 3. 10%-й розчин гідроксиду натрію.

Принцип методу.

Стійкість білків у розчині обумовлена наявністю гідратної оболонки і певного заряду молекули білка.

Порушення факторів, що стабілізують структуру молекули білка, призводить до осадження білків. Так, при кип'ятінні більшості білків порушуються зв'язки, властиві нативному стану молекули білка.

Кращий спосіб осадження білків – кип'ятіння в середовищах, що мають значення рН, рівне ізоелектричній точці білків. Внесення в розчин білка нейтральних солей (сульфату амонію, хлориду натрію й ін.) полегшує і прискорює осадження при кип'ятінні в результаті дегідратації білкових часток.

У сильнокислих і сильнолужних розчинах білок не випадає в осад, оскільки у кислому середовищі білок завжди буде мати позитивний заряд; у лужному – негативний.

Хід роботи. У пробірку вносять 2 мл розчину яєчного білка і нагрівають на киплячій водяній бані. Спостерігають утворення осаду (згортання білка).

Щоб порівняти залежність осадження білків від концентрації водневих іонів, у п'ять пробірок вносять по 2 мл розчину яєчного білка.

Нейтральний розчин білка в першій пробірці нагрівають до кипіння, спостерігається опалесценція (помутніння), обумовлена руйнуванням гідратної оболонки навколо молекули білка і збільшення білкових часток. Але міцели білка несуть заряд і тому залишаються в розчині, не випадаючи в осад.
Розчин у другій пробірці нагрівають до кипіння, вливають 1 мл 1%-го розчину оцтової кислоти до слабокислої реакції. При стоянні білок випадає в осад. У цих умовах частки білка втрачають заряд, тому що рН середовища близька до ізоелектричного стану.

У третю пробірку вносять 1 мл 10%-го розчину оцтової кислоти для створення кислої реакції середовища. При кип'ятінні розчину осад не утворюється, тому що молекули білка здобувають позитивний заряд, що підвищує їх стійкість.

У четверту пробірку додають 1 мл розчину оцтової кислоти, кілька краплин насиченого розчину хлориду натрію і нагрівають. Випадає білий осад. Його утворення обумовлене тим, що білок при взаємодії з іонами хлориду натрія втрачає свій заряд.

У п'яту пробірку вносять 1 мл 10%-го розчину гідроксиду натрію для створення лужного середовища. При кип'ятінні рідину осад не утворюється, тому що в лужному середовищі збільшується негативний заряд білка.

Результати щодо випадіння осаду заносять до таблиці, форма якої наведена нижче:

Нейтральне середовище	Слабокисле середовище	Кисле середовище	Кисле середовище + електроліт	Лужне середовище

1 2 3 4 5 6 7

Схожі:

Конспект заняття з біології на тему: «Будова, властивості, роль в життєдіяльності полісахаридів» Чим складні ліпіди відрізняються від простих? Наведіть приклади простих і складних ліпідів	З КОНТРОЛЮ ЯКОСТІ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ МІНІСТЕРСТВА ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ ЗАТ “Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод, які не відповідають вимогам ФС 42У-4-586-99 за показниками “Ідентифікація” (негативна...
Розглянуто на засіданні циклової Затверджую Визначення інформації і інформатики. Властивості інформації. Одиниці вимірювання інформації	1. Технічне та програмне забезпечення ЕОМ Визначення інформації і інформатики. Властивості інформації. Одиниці вимірювання інформації
Тема Підсумкове заняття. Як визначити якісний продукт (споживча культура) У повсякденному харчуванні обов’язково мають бути: білки, жири, вуглеводи, вітаміни, мінеральні речовини, клітковина, вода	Що потрібно для організму? Роль харчування у житті людини. Білки, жири, вуглеводи. Вітаміни. Мінеральні речовини та мікроелементи. Вода. Практична робота: робота...
УРОК №1 Тема. Початкові поняття геометрії. Властивості точок і прямих Узагальнивши практичні знання і вміння учнів, сформулювати властивості приналежності точок і прямих та властивості взаємного розміщення...	Лабораторнаробота №1 ВИЗНАЧЕННЯ ХЛІБОПЕКАРСЬКИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ПШЕНИЧНОГО... Мета роботи: засвоїти методики і визначити хлібопекарські властивості пшеничного борошна за кількістю і якістю клейковини, газоутворюючою...
УРОК №15 Тема. Узагальнення вивченого матеріалу з теми «Основні геометричні... Про означення, властивості суміжних та вертикальних кутів; а також про означення, ознаки та властивості паралельних прямих; повторити...	Василь КОЖЕЛЯНКО, Буковина України з від'ємного почав перетворюватися на додатній, тобто припинилося кількісне скорочення населення, мало того, воно почало...

Додайте кнопку на своєму сайті:
Портал навчання

1. Вуглеводи та ліпіди: властивості та кількісне визначення

Розчини, мл

Номер пробірки

Розчин казеїну

Схожі: