|
|
Скачати 1.31 Mb.
|
|
7.10 Застосування методу рекомбінантних ДНК у біодеградації Генетична селекція in vivo може забезпечити здатність організму до розкладу специфічної речовини. Але подібні методики потребують тривалого періоду селекції (8—10 міс., як описано вище) і грунтуються на випадковому наборі генетичного матеріалу для отримання бажаної катаболічної системи. Використання методів рекомбінантної ДНК дає експериментаторові можливість сполучати разом певні катаболічні послідовності і контролювати експресію специфічних генів. Рівень експресії, визначуваний in vivo, залежить від регуляторних механізмів, що кодуються плазмідними послідовностями, і мало що можна зробити, щоб вплинути на вихід окремих ферментів. Проте можна отримати підвищений рівень генного продукту, клонуючи певні гени у векторах по напряму транскрипції промоторних послідовностей. Застосування методів клонування для маніпуляції генами не може розглядатися як панацея, що забезпечує при всіх обставинах отримання мікробіологічних систем для боротьби з будь-якими забрудненнями. Є ряд обмежень при використанні методології клонування для отримання «суперштаму»:
Перше обмеженя вказує, що складна структура ксенобіотиків вимагає багатоетапних шляхів для досягнення повної мінералізації. Клонування одного або двох генів в організмі дає йому можливість разкладати речовину тільки тоді, якщо нові генні продукти доповнюють існуючі катаболічні системи. Лише в цьому випадку клонування розширить метаболічні можливості організму. Застосування цих методів дозволить більш направленно конструювати організм. Слід підкреслити, що навіть новітня методологія може використовуватися тільки для отримання організмів, здатних рости на одному або двох субстратах. Часто ця здатність залежить також від шкідливих мутаційних подій, що відбуваються внаслідок маніпуляцій in vitro, оскільки нашого розуміння генетичних механізмів ще недостатньо для направленого отримання бажаних генетичних форм. Це відображає недолік генетичних знань про ці організми, такі важливі для процесів біологічного очищення. На сьогодні добре розроблені методи клонування для Escherichia coli і декількох видів Bacillus і Streptomyces, а клонування для псевдомонад в основному складається з маніпуляцій з катаболічними плазмідами або їх частинами. Відсутність знань про метаболічні шляхи також обмежуються застосуванням методів рекомбінантної ДНК для прискорення прогресу в цій області. Без таких знань про метаболічні шляхи неможливо ідентифікувати гени, які найвигідніше клонувати, особливо ті, які лімітують набір субстратів або швидкість їх використання. Їх переваги наочно видно у разі двох описаних систем, де критичні етапи, лімітуючі набір субстратів метаболічного шляху, пов'язані з трьома ферментами метаболізму р-кетоадипату. Передумовою використання методів рекомбинантної ДНК є існування векторних систем для передбачуваного продуцента. Для ряду організмів, що використовуються для боротьби із забрудненнями, не існує добре охарактеризованих векторів. Один з можливих шляхів вирішення цієї проблеми — це використання векторів з широкого кола власників, наприклад вектора R300B. Коло власників цієї плазміди включає Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Methylophіlus methylotrophus і види Acinetobacter, Alcaligenes, Klebsiella, Proteus, Providencia, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Salmonella і Serratia. Використання таких векторів, знаходиться на ранній стадії, і одна з основних проблем цих систем — стабільність. Стабільність системи власник—вектор особливо важлива, якщо організм випускають в навколишнє середовище. Можливість використання сконструйованих організмів для боротьби із забрудненнями навколишнього середовища ще не перевірена за межами лабораторії. Пропозиції по маніпуляції природними ізолятами з подальшим поверненням їх в навколишнє середовище цікаві, але навряд чи здійсненні. Просте переміщення організму з навколишнього середовища і культивування його в лабораторії, особливо на збагаченому живильному середовищі, проявиться в селекції мутацій, які пристосовують організм до нових умов. Повернення організму в початкове середовище вже з забезпеченою новою катаболічною функцією, що дає йому можливість використовувати субстрат, недоступний решті членів мікробіологічної асоціації, і лише теоретично дає цьому організму селективну перевагу. Проте, природнє середовище буде містити і інші джерела вуглецю; скиди токсичних відходів зазвичай містять багато хімічних речовин, включаючи і легкозасвоювані. У таких умовах сконструйовані організми повинні володіти високою стабільністю, щоб забезпечити ефективніше використання цільової речовини. Мало або нічого не відомо про стабильність генетично вдосконалених рекомбінантних штамів в природному середовищі. Крім того, початкова природна популяція, добре адаптована до довкілля, подібна по своїй конкуренто спроможності генетично вдосконаленого штаму. Застосування методів рекомбінантної ДНК для отримання біологічних агентів для боротьби із забрудненнями знаходиться на ранній стадії, але є метод, який може виявитися корисним в майбутньому, — це генетичне зондування. Відбір організмів, здатних трансформувати нове з'єднання хімічних елементів, часто заснований на здатності використовувати речовину як субстрат росту. Якщо зростання слабке або субстрат тільки кометаболізується, то методи селекції виявляться непридатними для ідентифікації деградативной здатності. Отже, було б корисно розвивати генетичне зондування для визначення специфічних послідовностей в плазмидах і хромосомах, це необхідно для визначення катаболічного потенціалу, навіть якщо цей потенціал не експрессируется. Такі зонди розроблені для TOL-плазмид. Наукова група Сейлера використовували метод ДНК — ДНК-гібридизація для визначення катаболічного генотипу в мікроорганізмах з навколишнього середовища. Метод може визначити одну бактерійну колонію, що містить TOL-плазмиду, серед 106 колоній Escherichia coli. Такий могутній інструмент матиме величезне значення для виділення прихованих катаболічних функцій . Насьогодні існує велика різниця в місцях утилізації потенційних забруднень із стічних вод між: досягненнями в направленому конструюванні організмів і прикладною технологією використання сконструйованих організмів Промислові відходи і стічні води рідко є простими розчинами, що містили б одну речовину забруднення. Враховуючи обмеженість способів, якими можна маніпулювати окремими організмами, вірогідно, що найбільш ефективними будуть біологічні системи детоксикації, що складаються з мікробіологічного консорціуму індивідуальних організмів або їх співтовариств, отриманих шляхом, маніпуляцій in vivo і in vitro. Сучасні уявлення про фізіологічні, біохімічні і генетичні взаємини між компонентами співтовариства поклали в основу такого консорціуму якісний критерій, заснований на її здатності до ефективної детоксикації середовища. Для повного розкриття можливостей біотехнологічної боротьби із забрудненнями необхідно глибше вивчення кінетики окремих процесів. 7.11 Мікробні пестициди Біотехнологічні методи традиційно використовуються в сільському господарстві для підвищення родючості овочів, боротьби з шкідниками і збудниками хвороб культурних рослин і тварин, приготування продовольчих продуктів, їх консервації і поліпшення живильних властивостей. При цьому питома вага біотехнології для розвитку і підвищення ефективності традиційних сільськогосподарських технологій постійно зростає. В даний час особливі перспективи в створенні і розповсюдженні нових культивованих сортів рослин обіцяє застосування новітніх методів біотехнології - клітинній і генетичній інженерії. Зусилля біотехнологів направлені на збільшення виходу продукції і підвищення її поживності, посилення стійкості культивованих біологічних видів до несприятливих умов зовнішнього середовища, патогенам і шкідникам. При цьому залишається актуальною проблема підтримки різноманітності серед культивованих видів і збереження генетичних ресурсів в цілому. Використання мікробних пестицидів — альтернатива хімічним пестицидам та мінеральним добривам для оздоровлення сільськогосподарських земель та довкілля. При застосуванні мінеральних добрив окрім стимуляції росту, веде до накопичення нітратів, нітритів, пестицидів, гербіцидів в грунті та харчових продуктах, що негативно впливає на здоров’я, викликаючи хвороби алергічного характеру, чи зумовлює різке погіршення плодучості не залежно від кліматичних зон та типів грунту. В результате перед людством не зникає проблема зпбезпечення високої продуктивності сільскогосподарських культур та захисту рослин. Власне мінеральні добрива та хімічні протравники зерна і фунгіциди можуть бути замінені, як вважають біологи, біопрепаратами. Відомі біопрепарати, створені на основі бактерій та грибів, що утворюють симбіоз с корневою системою рослин, призначених для захисту рослин від хворіб, покращення їх мінерального живлення та стимуляції росту. Діючим началом біопрепаратів є бактерії та мікроскопічні гриби, що нселяють грунт, і шляхом селекції відібрані ті мікроорганізми, котрі добре приживаються в ризосфері або на коренях рослин, позитивно діючи на ріст та розвиток сільскогосподарських культур, та будучи безпечними для людини та тварин, а при внесені додатково в грунт можуть суттєво покращати її плодючість. Ще до недавнього часу біопестициди не привертали уваги крупних фірм. Багато компаній намагалися проводити і продавати продукти на основі Bacillus thuringiensis, але найчастіше відмовлялися від цього досить швидко, так як неможливо було виробити або продавати бактерійний Bt такими ж способами, як і хімічні пестициди, знайти такий же великий ринок збуту, і, нарешті, хіміками знову винаходилися нові і кращі хімікалії. Окрім того, невизначеність в реєстрації і непатентоспроможність більшості мікроорганізмів відлякували підприємців. Розвиток і можливості біотехнології біопестицидів з недорогими реєстраційними процедурами відкрив нові ринкові можливості через обмеження виробництв хімічних пестицидів за відсутністю перспектив у хімічного виробництва пестицидів через шкідливість впливу хімікалій на їжу та на довкілля завдяки розробленим багатоступеневим тест-системами, а також завдяки відкриттю нових хімічних речовин стає все більш дорогим заняттям і все менше компаній можуть собі дозволити витримувати витрати на введення нових хімікалій в ринковий обіг. Генна і білкова інженерія; виробництво бактерійних токсинів в рослинах, інших бактеріях і вірусах; швидке зростання знань про механізм дії грибів і про екологію вірусів підтримують упевненість, що традиційні недоліки біопестицидів: повільна дія, обмежена та непередбачувана ефективність, непатентоздатність, маленькі ринки збуту тощо—можуть бути подолані, хоч поза сумнівом, багато очікувань не виправдаються. Виробництво біопестицидів грунтується на культивуванні бактерійних штамів з тксичною дією на захворювання рослин, шкідників сільського господарства. Ефективні біопрепарати не накопичуються ані в плодах, ані в зеленій масі рослин та гарантують отримання екологічно чистого врожаю,забеспечують підвищеня якості продукції за рахунок збільшення вмісту в плодах вітамінів та цукрів, не зашкоджують грунтам, а навпаки, підвищують плодючість. До того ж, гектарная норма внесення біопрепаратів суттєво нища, ніж міндобрив. Застосуванння агробіотехнологій обходиться значно дешевше та екологічніше і безпечніше для здоров’я. Технологія виробництва біопрепаратів вельми різна, як різна природа і фізіологічні особливості микроогранизмів-продуцентів. Проте є ряд універсальних вимог, що ставляться до біопестицидів, основними серед них є: селективність і висока ефективність дії, безпека для людини і корисних представників флори і фауни, тривале збереження і зручність застосування, хороша змочуваність і пріліпаємость. В даний час для захисту рослин і тварин від комах і гризунів застосовуються, крім антибіотиків, близько 50 мікробних препаратів, що відносяться до трьох груп біопестицидів: бактерійні, грибні і вірусні препарати. 7.11.1 Бактерійні препарати з пестицидними властивостями. Бактерії в природі надзвичайно численні і мають гнучкий метаболізм, що дозволяє їм жити в будь-якій частині біосфери. Всього описано понад 90 видів бактерій, що інфікують комах. Велика частина належить до сімейств Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, Lactobacillaceae, Micrococcaceae і Bacillaceae. Біопрепарати Bt складають дещо більше 0,1 % світового виробництва пестицидів, проте це складає більше 90 % всіх мікробних пестицидів, що продаються. 7.11.2 Перспективи Bacillus thuringiensis. Зусилля учених і нововведення в технології застосування поліпшили сучасні продукти Bt. проте найзначніших досягнень можна очікувати від біохіміків і генетиків. Методи роботи з ДНК і плазмідами та результати досліджень учених по трансдукуючих фагах і трансформації протопластів були використані для доказу, зробленого науковцем Діном, того, що гени, контролюючі синтез кристалів, локалізовані у плазмідах зі значною молекулярною масою. Об'єднання білків з різних штамів дозволило розширити спектр активності рекомбинатного штаму. Однією фірмою успішно клонований токсичний білок в Е. coli і Bacillus subtilis, і він активно експресувався системою навіть протягом вегетативної фази зростання. Токсичний білок був токсичний для метеликів, введений в клітини тютюну, з яких було вирощено цілу рослину, кожна клітина нової рослини виробляла токсин, і рослина була «стійкою» до комах: поїдаючи листя, гусінь вмирає, не встигаючи заподіяти значної шкоди рослині. Нові біотехнологічні методики можуть внести свій внесок до підвищення ефективності шляхом зміни плазмид в бактеріях, контролюючих синтез білка. Це . очевидно, зменшить ціну продукції і забезпечить кращі характеристики біопрепаратів. З іншого боку, виробництво аспорогенних штамів може понизити вартість продукції через відсутність «зайвих» метаболічних витрат на виробництво спор і зробити продукт застосовним в тих країнах, де не хочуть розпилювати живі мікроорганізми в навколишнє середовище. 7.11.3 Грибні препарати з пестицидними властивостями Відомо більше 400 видів грибів, що заражають комах і кліщів, проте найбільше корисних для людини видів грибів є серед дейтероміцетів і фікоміцетів. Вони можуть розповсюджуватися в популяціях, викликаючи епізоотії, згублюючи ті особини, на котрих поселяються, але і контролюючи чисельність всій популяцій господаря протягом тривалого періоду. В деяких випадках своєчасне застосування достатнього числа грибних спор на ранніх стадіях може ефективно контролювати чисельність шкідників протягом зростання сільськогосподарської культури. Найбільш перспективними вважаються дві групи ентомопатогенних грибів - мускардні гриби з Euascomycetes і ентомотрофні з сімейства Entomophtohraceae. Серед них увагу привертають наступні грибні патогени: збудник білої мускардіни (рід Beauveria), збудник зеленої мускардіни (рід Metarhizium) і Enthomophthora (що вражає смоктальних комах). І. І. Мечніков, відкривши збудника зеленої мускардіни у хлібного жука і застосувавши препарат з гриба Metarhizium anisopliae, заклав основу новому напряму захисту рослин. У більшості грибів збудником інфекції є конідії. Гриби на відміну від бактерій і вірусів, проникають в тіло комахи не через травний тракт, а безпосередньо через кутикулу. При проростанні конідій на кутикулі комахи ростові трубки можуть розвиватися на поверхні або відразу починають проростати в тіло; часто цей процес супроводжується утворенням токсину. Якщо штам слабо продукує токсин, міцелій достатньо швидко заповнює все тіло комахи. Зараження комах грибними патогенамі на відміну від інших мікроорганізмів може відбуватися на різних стадіях розвитку (у фазі лялечки або імаго). Гриби швидко ростуть і володіють великою репродуктивною здатністю. На жаль, ефективність грибів вельми залежить від вологості і температури. Якщо вологість або температура сильно відрізняються від оптимального значення, знищзення шкідників буде слабким, і навряд чи почнеться бажана епізоотія. З цієї причини деякі з нині існуючих промислових грибних біопестицидів використовують проти оранжерейних шкідників. Оскільки потенційні втрати від шкідників і хвороб вельми великі та оранжереї дорогі в будівництві і експлуатації , власники оранжерей зазвичай застосовують більшу дозу хімікалій на одиницю площі, аніж інші виробники, що веде до появи стійкості шкідників до хімічних пестицидів і зростання потреби в них або пошуку альтернативних біопестицидів,витрати на придбання і застосування яких порівняно малі, тому вони зазвичай використовують біопестициди для вирощування дорогих культур, таких як квіти і позасезонні овочі. Науковці вважають, щоб зробити використання грибних біопестицидів ефективним, слід застосовувати їх вчасно і в оптимальній кількості, для цього необхідно знати етіологію пошкоджень: коли з'являються шкідники, звідки, що посилює їх атаки, чому іноді вони не з'являються? Слід зрозуміти, як шкідники взаємодіють з культурою і з іншими членами всього комплексу. Не дивлячись на згадані обмеження, гриби обіцяють бути економічно ефективними біопестицидами. Ряд грибів вже зараз широко використовується або досліджується. |
|
Конспект лекцій У двох частинах Частина 2 Суми Затверджено на засіданні кафедри фінансів як конспект лекцій з дисципліни «Банківський менеджмент» |
Конспект лекцій з дисципліни «Особливості водопостачання і водовідведення... Конспект лекцій з дисципліни «Особливості водопостачання і водовідведення промислових підприємств» (для студентів 5-6 курсів денної... |
|
Конспект лекцІй з дисципліни “ ПОТЕНЦІАЛ і розвиток ПІДПРИЄМСТВА”... Конспект лекцій з дисципліни “Потенціал і розвиток підприємства” для студентів ІV курсу / Укл доцент кафедри економіки підприємства... |
КОНСПЕКТ ЛЕКЦІЙ дисципліни «Історія економічних учень» |
|
Опорний конспект з дисципліни „Організація торгівлі” Міністерство... Опорний конспект лекцій з дисципліни „Організація торгівлі” для студентів напряму підготовки 030510 денної форми навчання / Укладач... |
ОПОРНИЙ КОНСПЕКТ ЛЕКЦІЙ з дисципліни “ ЕКОНОМІКА ПРАЦІ І СОЦІАЛЬНО... Конспект лекцій з дисципліни “Економіка праці і соціально-трудові відносини” для студентів ІІІ курсу. Павлоград: ЗПІЕУ, 2007 |
|
Конспект лекцій розроблений у відповідності до листа Міністерства... Короп Ігор Володимирович, Ревтюк Євген Антонович, Петренко Віктор Павлович – Інтелектуальна власність /Конспект лекцій для студентів... |
Конспект лекцій Частина II Суми Стратегічний маркетинг : конспект лекцій / укладачі: В. В. Божкова, Ю. М. Мельник, Л. Ю. Сагер. – Суми : Сумський державний університет,... |
|
КОНСПЕКТ ЛЕКЦІЙ для студентів економічних спеціальностей усіх форм навчання Проектний аналіз : конспект лекцій / укладачі: О. І. Карпіщенко, О. О. Карпіщенко. – Суми : Сумський державний університет, 2012.... |
КОНСПЕКТ ЛЕКЦІЙ з дисципліни «ЕКОНОМІЧНИЙ АНАЛІЗ» Сутність методу економічного аналізу, його характеристика та методологічна основа |