|
|
Скачати 375.51 Kb.
|
4.2. Клонування амфібій. Можливість клонування ембріонів хребетних уперше була показана наприкінці 40- х початку 50- х рр. у дослідах на амфібіях, коли російський ембріолог Георгій Вікторович Лопашов розробив метод пересадження (трансплантації) ядер у яйцеклітину жаби. У червні 1948 року він відправив в "Журнал загальної біології" статтю, написану за матеріалами власних експериментів. Однак, в серпні 1948 року відбулася сумно відома сесія ВАСХНИЛ, що затвердила з волі комуністичних правителів безмежне панування в біології малограмотного агронома Т. Д. Лисенко, і набір статті Лопашова, прийнятої до печатки, був розсипаний, тому що вона доводила провідну роль ядра хромосом, що й утримуються в ньому, в індивідуальному розвитку організмів. Роботу Лопашова забули, а в 50- х рр. американські ембріологи Бриггс і Кинг виконали подібні досліди, і пріоритет дістався їм, як це часто траплялося в історії російської науки. Бріггс і Кінг розробили мікрохірургічний метод пересадження ядер ембріональних кліток за допомогою тонкої скляної піпетки в позбавлені ядра клітини. Вони встановили, що якщо брати ядра із клітин зародка на ранній стадії його розвитку - бластулі (бластула - стадія в розвитку зародка, що представляє собою повну кулю з одного шару клітин), та приблизно в 80% випадках зародки благополучно розвиваються далі й перетворюються в нормального пуголовка. Якщо ж розвиток зародків просунувся на наступну стадію - гастулу, то лише менш ніж в 20% випадків оперовані клітини розвивалися нормально. Ці результати пізніше були підтверджені в інших роботах. Великий внесок у цю область вніс англійський біолог Гердон. Він перший у дослідах з південноафриканською жабою Xenopus laevіs у якості донора ядер використовував не зародкові клітини, а клітини, що вже цілком спеціалізувалися, епітелію кишечнику плаваючого пуголовка. Ядра яйцеклітин - реципієнтів він не видаляв хірургічним шляхом, а руйнував ультрафіолетовими променями. У більшості випадків реконструйовані яйцеклітини не розвивалися, але приблизно десята частина з них утворювала ембріони, 5% із цих ембріонів розвивалися до стадії бластули, 2,5% стадії пуголовка й тільки 1% розвивалося в статевозрілі особини. Однак поява декількох дорослих особин у таких умовах могло бути пов'язане з тим, що серед кліток епітелію кишечнику, що розвивається пуголовка досить довгостроково присутні первинні статеві клітини, ядра яких могли бути використані для пересадження. У наступних роботах, як самого автора, так і інших дослідників не змогли підтвердити дані цих перших досвідів . Пізніше Гердон модифікував експеримент. Оскільки, більшість реконструйованих яйцеклітин з ядром клітин кишкового епітелію гинуть до завершення стадії гастули, він спробував витягти з них ядра на стадії бластули й знову пересадити їх у нові энуклейовані яйцеклітини, така процедура називається "серійним пересадженням". Число зародків з нормальним розвитком після цього збільшилося, і вони розвивалися до більш пізніх стадій у порівнянні із зародками, отриманими в результаті первинного пересадження ядер. Потім Гердон разом з Ласки (1970 р.) стали культивувати іn vіtro (поза організмом у живильному середовищі) клітини почки, легені й шкіри дорослих тварин і використовувати вже ці клітини як донорів ядер. Приблизно 25% первинно реконструйованих яйцеклітин розвивалися до стадії бластули. При серійних пересадженнях вони розвивалися до стадії пуголовка. Таким чином, було показано, що клітини 3- х різних тканин дорослого хребетного містить ядра, які можуть забезпечити розвиток до стадії пуголовка. У свою чергу Диберардино й Хофнер використовували для трансплантації ядра нероздільних і повністю дифференційованих клітин крові - еритроцитів жаби Rana. Після серійного пересадження таких ядер 10% реконструйованих яйцеклітин досягали стадії плаваючого пуголовка. Однак навіть за допомогою багаторазових серійних пересаджень (більш 100 клітинних циклів) реконструйовані яйцеклітини, далі стадії пуголовка не розвивалися. Таким чином, у багатьох роботах показане, що у випадках амфібій донорами ядер можуть стати лише зародки на ранніх стадіях розвитку. Деякі автори називають подібні експерименти клонуванням амфібій, хоча вірніше їх називати клонуванням ембріонів амфібій, тому що в цьому випадку розмножують безстатевим шляхом не дорослих тварин, а їх зародків. Дифференціювання клітин у ході розвитку хребетних супроводжується інактивацією непрацюючих генів, тому клітини втрачають тотипотентність, дифференціювання стає неповоротнім. Зрештою, в одних клітин відбувається репресування генома, в інших тією чи іншою мірою деградує ДНК, а в деяких випадках руйнується навіть ядро. Однак на ряді з дифференційними клітинами, культивованими іn vіtro клітинні популяції містять малодифференційні стовбурні клітини, які й можуть бути використані як донори ядер для клонування ссавців. Досліди з амфібіями показали, що ядра різних клітин того самого організму генетично ідентичні й у процесі дифференціювання поступово втрачають здатність забезпечувати розвиток реконструйованих яйцеклітин, однак серійні пересадження ядер і культивування кліток іn vіtro у якійсь мірі збільшують цю здатність . 4.3. Клонування мишей. Успішні досвіди з амфібіями змусили задуматися вчених про клонування ссавців, зокрема мишей. Мак Киннелл в одній зі своїх роботах відзначав, що необхідні для цього методи вже існують і незрозуміло чому миша дотепер не клонована. Однак, його пророкування не збулися, хоча наприкінці 70- х рр. досвіди на мишах дійсно почалися й протікали досить драматично. На той час досить ґрунтовно були вивчені біологія й генетика ранніх етапів розвитку ссавців і зокрема миші як модельного об'єкта. Робота методично виявилася досить важкою, насамперед тому, що обсяг яйцеклітини в ссавців приблизно в тисячу раз менша, чим в амфібій. Однак ці труднощі були успішно переборені. Експериментатори навчилися успішно мікрохірургічним шляхом видаляти пронуклеуси (одне із двох гаплоїдних ядер у яйці ссавців, у період після проникнення сперматозоїда, але до злиття жіночого й чоловічого пронуклеусів у ядро зиготи в процесі запліднення. Чоловіче ядро формується з ядерного матеріалу сперматозоїда, жіноче із хромосом яйцеклітини) із зигот миші й пересаджувати в них клітинні ядра ранніх ембріонів. Однак усі отримані різним способом зародки мишей розвивалися лише до стадії бластули. В 1977 році з'явилося сенсаційне повідомлення Хоппе й Ілменсе про те, що вони одержали 7 дорослих самок мишей, п'ять із яких мали тільки материнський, а дві батьківський геном. Це, нібито, залежало від того, який пронуклеус був залишений у яйці - жіночий або чоловічий, він і визначав особини по типу гіногенезу або андрогенезу (гіногенез - розвиток яйця без участі сперматозоїда, андрогенез - розвиток яйця, що мають тільки батьківські хромосоми - чоловічий партеногенез). Їхній успіх був зв'язаний, по опису авторів, з тим, що, видаляючи один пронуклеус, вони подвоювали число хромосом іншого, обробляючи яйця спеціальною речовиною, потім вирощували отримані диплоїдні гомозиготні зародки іn vіtro до стадії бластули й пересаджували в матку самки- реципієнта для подальшого розвитку. Здавалося б, тепер можна буде швидко одержати ссавців з 100% гомозиготністю по всіх ознаках. Це особливо важливо для селекції, тому що для одержання сільськогосподарських тварин, зокрема великої рогатої худоби із закріпленими особливо цінними якостями звичайними способами потрібні десятки років роботи. Однак дані Хоппе й Ілменсі підтвердити не вдалося, хоча багато хто намагалися це зробити. Виявилося, що отримані будь-яким способом диплоїдні андрогенетичні та гіногенетичні зародки мишей гинуть, на тих же стадіях, що й диплоїдні партеногенетичні (що, розвиваються з незаплідненої яйцеклітини) ембріони. Значно вдосконаливши методи витягу ядер і введення їх у клітину, Мак Грат і Солтер провели свою серію експериментів і повідомили, що високий вихід живих мишей вони одержали, коли в якості донорів ядер вони використовували зиготи, але якщо донорами були ранні ембріони, то реконструйовані яйцеклітини, як і колись, розвивалися тільки до стадії бластули. Метод Мак Грата і Солтера став широко використовуватися різними експериментаторами. Так Манн і Ловел - Банж виділяли пронуклеуси яєць, активованих до партеногенезу, і пересаджували їх в енуклейовані зиготи мишей. У цих випадках ембріони гинули на ранніх стадіях. Якщо ж, навпаки, пронуклеуси одержували із запліднених яєць і пересаджували в партеногенетичні й позбавлені ядра яйця, то такі зародки розвивалися нормально до народження. Сурані зі співавторами встановили, що якщо додати жіночий пронуклеус із зиготи миші до гаплоїдного набору хромосом яйцеклітини, то нормального розвитку не відбувається, додавання ж чоловічого ядра приводить до нормального розвитку. З іншого боку, рекомбінація жіночого й чоловічого пронуклеусов з ранніх запліднених яйцеклітин мишей забезпечує нормальний розвиток, а комбінація 2 - х чоловічих або 2 - х жіночих пронуклеусов зупиняє розвиток ембріона. Ці досліди показали, що для нормального розвитку ссавців потрібно два набори хромосом - батьківський і материнський. Тому в жодного з відомого виду ссавців не описаний партеногенез. Тому ж роботи Хоппе й Ілменсе не вдалося повторити. Однак такі дослідження ще двічі хвилювали наукове співтовариство. В 1982 році пересадили ядра клітин партеногенетичних бластул мишей в енуклейовані зиготи. Деякі із цих реконструйованих яйцеклітин нормально розвивалися, і нібито отримано чотири дорослі самки, але у світлі вищесказаного ці результати малоймовірні. Загибель партеногенетичних (гіногенетичних і андрогенетичних) зародків у ссавців пов'язана з різною активацією онтогенезу материнського й батьківських геномів. Механізм, що регулює ці функціональні відмінності, був названий геномним імпритингом і вивчався в ряді робіт, де було показано, що для нормального розвитку ссавців потрібне наявність чоловічого генома. Інша стаття Ілменсе й Хоппе мала ще більший резонанс. Автори повідомили про пересадження ядер внутрішньої клітинної маси бластули в енуклейовані зиготи мишей і одержання трьох дорослих особин (двох самок і одного самця), генетично ідентичної донорської лінії мишей. Уведення ядер - донорів і видалення пронуклеусів із зиготи проводили за одне приймання, потім реконструйовані яйцеклітини культивували іn vіtro до стадії бластули й пересаджували в матку самок. З 16 пересаджених бластул три розвилися в дорослі особини. У наступній роботі ці ж автори використовували як донори- ядер клітин ембріонів ще більш пізньої стадії (сім діб) і нібито одержали трьох статевозрілих мишей. Однак ніхто із працюючих у тому ж напрямку не зміг добитися подібних результатів, і вірогідність результатів Ілменсе й Хоппе знову була поставлена під сумнів. Мак Грат і Солтер показали, що ядра 8- клітинних зародків і кліток внутрішньої клітинної маси бластули не забезпечують розвитку іn vіtro реконструйованих яйцеклітин навіть до стадії морули, яка передує стадії бластули. Найбільша частина (5%) 4- клітинних зародків дає можливість розвиватися тільки до стадії морули. У теж час 19% реконструйованих яйцеклітин 2- ядерних клітинних зародків, змогли спокійно досягтися стадії морули або бластули. Ці й інші дані показують, що в ембріогенезі в мишей клітинне ядро рано втрачає тотипотентність, що зв'язане, мабуть, з дуже ранньою активізацією генома зародка - уже на стадіях двох клітин. В інших ссавців, зокрема в кроликів, овець і великої рогатої худоби, активізація першої групи генів в ембріогенезі відбувається пізніше, на 8-16 клітинній стадії. Можливо, тому перші значні успіхи в клонуванні тварин були досягнуті на інших видах ссавців, а не на мишах. Проте, особливий інтерес викликають досвіди групи вчених з університету в Гонолулу на чолі з Ріузо Янагімачі. Авторам удалося вдосконалити метод Уілмута, про який мова йтиме нижче, вони відмовилися від електричної стимуляції злиття донорської соматичної клітки з яйцеклітиною й винайшли таку мікропіпетку, за допомогою якої можна було б безболісно витягати ядро із соматичної клітини й трансплуатувати його в безядерну клітину. Крім того, автори використовували в якості донорських відносно менш диференційовані ядра кліток, що оточують ооцит. Нарешті, удалося, як би синхронізувати процеси, що протікають у яйцеклітині й трансплантаційному у ньому ядрі, що дозволило забезпечити природні ядерно-цитоплазматичні взаємини між ядром і цитоплазмою, оскільки трансплантаційне диференційоване в певному напрямку ядро й цитоплазма яйцеклітини до того працювали як би в різних режимах. Автори використовували для трансплантації ядра клітин, що оточують ооцит (клітин так званого cumulus oophorus), кліток Сертоли з насінників і клітин, виділених з мозку. Ядра, виділені із соматичних кліти, інєкційовані в енуклейоване яйце за допомогою мікропіпетки. Яйце активували до розвитку, помістивши в спеціальний розчин (так званий HEPES-CZB), вільний від кальцію, і додаючи стронцій і цитохалазин. Стронцій активував яйце, а кальцій пригнічував утвір полярних тілець. Ембріонів культивували до стадії 2-8 клітин, морули або бластули, а потім трансплантували в матку приймальної матері, де багато хто з них імплантувалися і деякі з них (15-16%) продовжували свій розвиток. Відсоток виходу породжених мишенят (їх витягали за допомогою кесарева перетину на 18, 19- й дні вагітності) був, однак, низьким - у різних серіях експериментів від 2 до 2,8%. Молекулярні дослідження довели приналежність ядер породжених мишенят до клітин донора соматичних кліток .Таким чином, принаймні в деяких випадках доведена здатність ядер соматичних клітин забезпечувати нормальний розвиток ссавців. Проте, роботи з мишами, незважаючи на їхню непросту долю, значно розширили наші уявлення про методологію ссавців. 4.4. Клонування кроликів та корів. Американські дослідники Стік і Робл, використовуючи метод Солтера й Мак Грата, одержали шість живих кроликів, пересадивши ядра 8- клітинних ембріонів однієї породи в позбавлені ядра яйцеклітини кроликів іншої породи. Фенотип народжених повністю відповідав фенотипу донора. Однак тільки 6 з 164 реконструйованих яйцеклітин (3,7%) розвилися в нормальні тварини. Це, звичайно, дуже низький вихід, що практично не дозволяє розраховувати на одержання таким способом клону генетично ідентичних тварин. Цінність цієї роботи, у тому, що вона показала можливість клонування ембріонів кроликів. Робота з реконструйованими яйцеклітинами великих свійських тварин, корів або овець, іде трохи по-іншому. Їм спочатку культивують не іn vіtro, а іn vіvo - у перев'язаному яйцепроводі вівці - проміжного (першого) реципієнта. Потім їх звідти вимивають і трансплантують у матку остаточного (другого) реципієнта - корови або вівці відповідно, де їх розвиток відбувається до розвиненого дитинчати. Уіландсін запропонував укласти реконструйовані яйцеклітини в агаровий циліндр, який він потім трансплантував у перев'язаний яйцепровід вівці або корови. За даними одних авторів реконструйовані зародки краще розвиваються в яйцепроводі, чим в культивованім середовищі, хоча деякі дослідники одержали непогані результати й при культивуванні іn vіtro. Американці Робл і його співробітники використовували щадящий метод витягу ядра без проколювання мембрани яйцеклітини, запропоновані Мак Гратом і Солтером, пересаджували в зиготи так звані каріопласти - чоловічий і жіночий пронуклеуси разом з навколишньою їхньою цитоплазмою, а також ядра 2-, 4- або 8- клітинних ембріонів корови. Спочатку пронуклеуси центрифігували, щоб звільнити пронуклеуси від навколишніх їхніх гранул жовтка, після чого ядра були добре видні під мікроскопом, що значно полегшувало їхнє видалення. За допомогою маніпулятора й загостреної скляної піпетки витягали один із бластомерів разом з ядром з ранніх зародків і переносили його в енуклейовану зиготи. Реконструйовані зародки були укладені в агаровий циліндр і пересаджені в перев'язаний яйцепровід вівці. Через п'ять днів культивування їх вимивали, звільняли від агару й досліджували. Реконструйовані зародки в цьому випадку розвивалися тільки в тих випадках, де зиготи в зиготи пересаджували пронуклеуси: 17% таких зародків досяглися стадії морули або бластули. Два зародки були пересаджені другому реципієнтові - у матку корови й розвиток їх завершився народженням живих телят. Якщо в якості донорів використовували ядра 2-, 4- і 8- клітинних зародків, то реконструйовані яйцеклітини не розвивалися навіть до стадії морули. Пізніше були й більш успішні роботи. Уіландсін, зокрема , повідомив що йому вдалося одержати чотирьох генетично ідентичних бичків холстейскої породи в результаті пересадження в реципиентні яйцеклітини ядер бластул одного 32- клітинного зародка. Автор затверджував, що більшість ядер зберігають тотипотентність на 32- клітинній стадії, а значна їхня частина 64- клітинної стадії, забезпечуючи нормальний розвиток реконструйованих яйцеклітин до стадії морули в яйцепроводі. Після пересадження в матку корів - остаточних реципієнтів. Як уважає автор, вони можуть і далі нормально розвиватися. Бондіолі й співавтори, використовуючи в якості донорів ядер 64- клітинні зародки корів, трансплантували 463 реконструйовані зародків в матку синхронізованих реципієнтів, і було отримано 92 живих телят. Сім з них були генетично ідентичні, представляючи собою клон, отриманий у результаті пересадження ядер клітин одного донорського ембріона. Таким чином, клітинні ядра зародків великої рогатої худоби досить довго зберігають тотипотентність і можуть забезпечити повний розвиток реконструйованих яйцеклітин. Інакше кажучи, методичні труднощі клонування зародків великої рогатої худоби практично вирішені. Але залишається основне завдання - знайти донорські ядра, що володіють тотипотентністю, для клонування дорослих тварин. |
| Реферат З б іології На тему: Клонування Тому Церква не є прихильницею безкритичного оптимізму. Це відкриття нового “континенту”, яким є знання про людський генотип, пропонує... |
Закон спадної віддачі Закон спадної віддачі закон, згідно з яким,... Ринок складається з великої кількості продавців, кожний з яких продає стандартизовану продукцію великій кількості покупців |
| ЗАКОН УКРАЇНИ Цей Закон визначає статус державної податкової служби в Україні, її функції та правові основи діяльності |
Статеве і нестатеве розмноження Мета: узагальнити знання учнів про форми розмноження організмів; розвивати вміння учнів порівнювати статеве і нестатеве розмноження,природне... |
| ЗАКОН УКРАЇНИ Про захист прав споживачів. ЗАКОН УКРАИНЫ О защите... Цей Закон регулює відносини між споживачами товарів (робіт, послуг) і виробниками, виконавцями, продавцями в умовах різних форм власності,... |
Закон УкраЇни Цей Закон визначає правові та організаційні засади провадження торговельної діяльності на роздрібних продовольчих і непродовольчих... |
| ЗАКОН УКРАЇНИ Цей Закон встановлює правові та організаційні основи містобудівної діяльності і спрямований на забезпечення сталого розвитку територій... |
Закон України „Про захист суспільної моралі” Цей Закон встановлює правові основи захисту суспільства від розповсюдження продукції, що негативно впливає на суспільну мораль |
| ЗАКОН УКРАЇНИ Цей Закон встановлює правові та організаційні основи містобудівної діяльності і спрямований на забезпечення сталого розвитку територій... |
ЗАКОН УКРАЇНИ Цей Закон визначає правові засади організації і діяльності адвокатури та здійснення адвокатської діяльності в Україні |