Біотехнологія одержання гормонів
Одержання інсуліну.
2% населення Землі хворі на діабет
20% хворих на діабет потребують ін’єкцій інсуліну
З усіх людей віком 8-12 років 0,25% хворі; 40-50 років - 3%; старші 70 років -7%.
Діабет займає третє місце після серцево-судинних і онкологічних захворювань.
Перші досліди по використанню інсуліну для лікування проведені у 1922 році.
Отримання інсуліну з природної сировини
Недоліки:
Обмеженість сировини (підшлункової залози).
При ін’єкціях інсуліну виділеного з підшлункової залози корови в організмі виробляються антитіла до цього інсуліну, які інактивують його, тобто зменшується тривалість біологічної дії препарату.
В таких препаратах є домішки інших білків які теж викликають утворення антитіл, тому в місці повторного введення препарату атрофується підшкірний жировий прошарок.
Хімічний синтез інсуліну
1963 рік ФРН, США, Китай
Недоліки:
1) Трудомісткий (близько 170 реакцій). 2) Важко було синтезувати дисульфідні зв’язки, тому спочатку синтезували проінсулін.
Інформація про структуру інсуліну закодована в 11 хромосомі.
Поліпептид А – 63 пари основ. Поліпептид В – 90 пар основ.
Отримання інсуліну з використанням рекомбінантних ДНК.
Перші досліди 1979 рік. Широке виробництво 1981 рік.
Eli Lilly and Co. спільно з Genentech. Inc.
1. Окремий синтез генів що кодують поліпептиди (ланцюги) А і В (послідовність ДНК відтворили по амінокислотній послідовності інсуліну).
2. Вбудовування кожного гена в середину гена β-галактозидази плазміди.
3. Введення плазмід в клітину E.coli.
4. Клітини вирощують на середовищі з лактозою і в них індукується синтез β-галактозидази (цей ензим розщеплює лактозу на галактозу і глюкозу). Разом з β-галактозидазою синтезуються поліпептиди А і В приєднані до неї через залишки метіоніну.
5. Лізис бактерій і обробка бромціаном (N≡C-Br), що розщеплює білки специфічно по залишку метіоніну. Інсулін метіоніну не має і тому його поліпептиди не зруйнуються, а зруйнується β-галактозидаза.
6. Очистка поліпептидів А і В та їх об’єднання.
7. Створення дисульфідних зв’язків, для об’єднання поліпептидів А і В, було складне, тому синтезували проінсулін, який потім β-карбоксипептидазою розщепили до інсуліну.
Виділення з β-клітин острівців Лангерганса м-РНК, яка кодує структуру проінсуліну.
Синтез комплементарної ДНК на М-РНК методом зворотної транскрипції.
На отриманому ланцюзі ДНК синтез іншого ланцюга ДНК і отримання гену проінсуліну.
Нарощування на кінцях гена тетрануклетидів цитидилу “липкі кінці”.
Розрізання рестриктазою гена пеніцилінази (цей ензим відповідає за стійкість до пеніциліну) в плазміді PBR-382.
Нарощування гуанілових “липких кінців” на розрізаних кінцях гена плазміди.
Вмонтовування гена проінсуліну в плазміду.
Введення плазміди в E.coli.
Синтез проінсуліну геном, який до модифікації синтезував пеніциліназу.
Обробка проінсуліну трипсином для відщеплення С-пептиду.
Між С-кінцями В-ланцюгів інсуліну формуються водневі зв’язки і утворюються димери інсуліну, які в присутності йонів цинку формуюють гексамери.
Мономери і димери легко дифундують в кров, а гексамери погано.
Інсулін-ліспро – перший рекомбінантний аналог інсуліну. В ньому поміняні місцями залишки лізину і проліну. Це зменшило формування димерів і гексамерів і не вплинуло на зв’язування гормону з рецепторами.
Одержання соматотропіну.
Отримання соматотропіну з природного матеріалу
З гіпофізу однієї людини можна отримати 4-6 мг гормону.
При лікуванні однієї дитини вагою 10-20 кг для введення соматотропіну в дозі 6-10 мг/кг ваги 3 рази на тиждень на протязі 4-5 років треба отримати соматотропін від 15 000 трупів.
У 1981 році в США отримали соматотропін з 60 000 трупів, в Англії – 70 000.
Недоліки методу отримання з природного матеріалу:
Обмеженість сировини.
Можливе зараження матеріалу вірусами.
Можливе утворення в організмі пацієнта антитіл до отриманого препарату.
Виробництво соматотропіну на основі технології рекомбінантних ДНК (Kabi Vitrum з Genentech Inc.)
1) Виділення м-РНК. 2) Синтез к-ДНК. 3) Синтез другого ланцюга ДНК. 4) При введення такого гену в E.coli синтез соматотропіну не відбувався. 5) Ген розрізали на дві частини (кодують 1-23 і 24-191 амінокислотні залишки). 6) З’єднали дві частини і вмонтували в E.coli штам К12, яка синтезувала соматотропін.
Біотехнологія одержання ІНТЕРФЕРОНІВ
У 1957 році Alick Issacs (шотландець) та Jean Lindenmann (швейцарець) встановили, що при інфікування ембріону курки вірусом грипу, клітини продукують білки, що руйнують вірус та пригнічують розвиток інших вірусів в ембріонах. Білки назвали інтерферонами, через їх здатність перешкоджати (interfere with) реплікації вірусів.
Інтерферони це білки, що продукуються клітинами імунної системи хребетних у відповідь на віруси, паразити чи пухлинні клітини.
І. є частиною неспецифічної імунної системи і виробляються на перших етапах інфікування вірусом до відповіді специфічної імунної системи.
І. зв’язуються із рецепторами на поверхні клітин, та індукують транскрипцію окремих генів, чим надають клітинам антивірусний статус.
Типи інтерферонів:
Тип І. Не виробляються нормальними клітинами, а лише тими, що інфіковані вірусами. Спричинюють продукцію інтерферонів ДНК, одно- та дволанцюгова РНК, ліпополісахариди:
Інтерферон α (лейкоцитарний) виробляється лейкоцитами, що інфіковані вірусами;
Інтерферон β (фібробластний) виробляється фібробластами, що інфіковані вірусами, або епітеліальними клітинами, що інфіковані вірусами;
Інтерферон ω.
Тип ІІ. Виробляються у відповідь на антигени (включаючи і антигени вірусів) чи мітогени:
Інтерферон γ (імунний) виробляється лімфоцитами.
Тип ІІІ.
CRF2-4 та CRF2-12.
У 1980 році отримали інтерферон α 2а, який за допомогою технології рекомбінантних ДНК виробили дріжджі Reiferon Retard
Загальний продаж препаратів інтерферонів 5 000 000 000 $
Використання інтерферонів:
Інтерферони α і β для лікування вірусних інфекцій (α – гострий та хронічний гепатит С та хронічний гепатит В).
Інтерферон γ при потребі активації макрофагів (лейшманіоз, токсоплазмоз).
Інтерферони мають антипроліферативний ефект, тому їх використовують при лікування меланоми, лейкемії, лімфоми, СНІД залежної саркоми Kaposi’s.
Препарати інтерферону:
Rebif, liquid form of Interferon beta 1a; Avonex, lyophilized form of Interferon beta 1a; Cinnovex, загальна form of Interferon beta 1a (Avonex); Betaseron, Interferon beta 1b; Roferon A. нормальний Interferon-alpha2a; Intron-A, нормальний Interferon-alpha2b; PEGASYS, Pegylated Interferon alpha 2a; Berlex, Interferon beta 1b; PegIntron, Pegylated Interferon alpha 2b; Reiferon Etard , pegylated Interferon alpha 2a.
Біотехнологія одержання вакцин нового покоління
Вакцини з нуклеїнових кислот.
Генні вакцини.
Генетичні вакцини.
Полінуклеотидні вакцини.
Термін “ДНК-вакцини” може сформувати помилкову думку що вони вносять зміни в генетичну структуру організму (тварин, людини).
1990 рік - початок розробок.
У 1992-1993 роках доведено, що введення чужорідної ДНК в організм тварини сприяє формуванню імунітету
Етапи отримання вакцин, і формування ними імунітету:
Від збудника (прокаріот) отримують гени що кодують імуногенні білки
Вмонтовують ці гени в плазміду. Отримують рекомбінантну плазміду.
Вмонтовують до цих генів промотор, який дозволить експресувати гени в клітинах еукаріотичних організмів (тварин, людини).
Вводять цю рекомбінантну плазміду в бактеріальні клітини, щоб отримати велику кількість копій цієї плазміди.
Виділяють і очищують отримані копії рекомбінантної плазміди від домішок. Очищена ДНК і є вакциною
В цю ДНК в організм еукаріот (тварини, людина), де вона проникає в клітини.
В клітинах синтезуються імуногенні білки, що закодовані у вбудованих гена отриманих від збудника.
Ці білки виходять з клітин і спричинять імунну відповідь організму, який набуває імунітет.
Методи введення ДНК-вакцин:
Парентерально (в/м’язово, підшкірно). Вакцина потрапляє у міжклітинний простір (при цьому частково руйнується), а потім в клітину.
За допомогою генного пістолета. Вакцина потрапляє в клітину. ДНК-вакцина фіксують на мікроскопічних золотих гранулах (1-2 мкм) і вистрілюють струменем стиснутого гелію. Основна перевага цього методу необхідно нанограми вакцини, а при класичній вакцинації – мікрограми білка.
Переваги ДНК-вакцин над “традиційними” вакцинами:
Підвищена ефективність і безпека імунізації.
Спрощення процесів розробки та виробництва нових вакцин.
Менші вимоги до умов зберігання.
Біотехнологічне виробництво незамінних амінокислот
Незамінні амінокислоти (для людини і тварин):
лізин, лейцин, ізолейцин, валін, метіонін, треонін, триптофан, фенілаланін, гістидин, аргінін (частково синтезується в орнітиновому циклі)
В рік у світі виробляють 200 000 000 кг амінокислот
Застосування амінокислот:
Кормові добавки для збагачення рослинних білків (лізин, триптофан, треонін, метіонін). 66% усіх амінокислот.
Харчові: глутамат Na (підсилювачі смаку); гліцин (підсолоджувач, бактеріостатик і антиоксидант); аспартам – дипептид фенілаланіну і аспарагінової кислоти (в 100 разів солодший від цукру). 30% усіх амінокислот.
Фармацевтична, хімічна і косметична промисловість. 4% усіх амінокислот.
Методи одержання незамінних амінокислот:
1. Мікробіологічний синтез
Використовують з початку 50-х років ХХ сторіччя.
Отримують 60% усіх амінокислот, що виробляють.
Переваги: 1) отримання L-форм амінокислот; 2) прибутковіший порівняно з іншими методами; 3) на одному підприємстві отримують кормові препарати та особливо чисті індивідуальні амінокислоти для медицини, фармацевтичної та харчової промисловості.
2. Хімічний синтез:
Основний недолік – отримання рацематів (сумішей D- і L-форм), які необхідно очищувати, бо D-форм, як правило, є баластними, не засвоюються організмом людини і тварин, а у деяких випадках вони навіть токсичні. Виключенням є метіонін (D- і L-форми засвоюються) і гліцин ( не має оптичних ізомерів).
Цим методом у великих кількостях отримують гліцин і метіонін.
3. Виробництво амінокислот з білкових гідролізатів:
Суть методу: здійснюють гідроліз (кислотний, лужний, ферментативний) доступних природних білків (відходи м’ясної і молочної промисловості, казеїн молока, клейковина пшениці…)
Недоліки: 1) обмеженість сировини; 2) багато стадій процесу виділення і очищення амінокислот; 3) при неорганічному (мінеральному) гідролізі частково руйнуються амінокислоти, а використання протеолітичних ензимів не забезпечує гідроліз усіх пептидних зв’язків.
Бітехнологічне виробництво білка
На початок ХХІ сторіччя світовий дефіцит білка 35 000 000 тон.
Основне біотехнологічне виробництво білка – кормовий білок.
Єдиний офіційно дозволений білок мікроорганізмів, який можна споживати людині – мікопротеїн, що складається з міцелію виділеного з грунту гриба, штам Fusarium graminearum.
Згодувавши 1 кг корму отримують 14 г білку (69 г м’яса) яловичини, 41 (200) свинини, 49 (240) курчатини.
1 кг вуглеводів + неорганічний азот – це 136 г білку (1080 г сирої клітинної маси) Fusarium graminearum, який в перерахунку на суху вагу містить 47% білку, 14% жирів, 10% вуглеводів, 3% золи і 1% РНК.
Переваги біотехнологічного виробництва білка:
Мікроорганізми швидше ніж тварини і рослини накопичують біомасу (до 5 000 разів).
Мікроорганізми містять багато білку – в дріжджах міститься до 60% білку, в мікроорганізмах – до 75% білку.
Процес біотехнологічного виробництва білку менше трудомісткий ніж отримання с/г продукції чи органічний синтез білків.
1. Отримання мікробного білка на вуглеводній сировині:
Гідролізати рослинної сировини.
Гідролізати торфу.
Зернокартопляна і мелясна браги.
2. Отримання мікробного білка на нищих спиртах:
Метанол.
Етанол.
3. Отримання мікробного білка на вуглеводневій сировині:
Очищені парафіни.
Нафтові дистиляти.
Природний газ.
Бітехнологічне виробництво ферментних препаратів
У 1890 році почали виробляти препарат α-амілазу (виділили з Aspergillus oryzae), який рекомендували як засіб для покращення травлення.
В середині ХХ сторіччя почалось широке виробництво субтилізину Carlsberg (B.subtillis).
Сьогодні 99% усіх ферментів – це 16 препаратів. Їх поділяють на 4 групи:
Протеолітичні ферментні препарати (59%) використовують в медицині (лікування запальних процесів, опіків, тромбозів), виробництво сиру (ренін), м’ясна промисловість (пом’якшення м’яса), шкірна промисловість (пом’якшення і зневоднення шкіри), миючі засоби, кіно (розчинення желатинового шару плівок – застаріло), парфумерія.
Целюлозолітичні (виділення стероїдів з рослині і харчова промисловість), амілолітичні (спиртова і хлібопекарська промисловість) та пектинолітичні (харчова і текстильна промисловість) – 28%.
Ліпази – 3%.
Решта – 10%.
Методи культивування:
Глибинний – вирощування мікроорганізмів в рідкому поживному середовищі. Частка ферменту 0,1%.
Поверхневий – культура мікроорганізмів росте на поверхні твердого зволоженого середовища. Часка ферменту 1%.
Стадії отримання ферментних препаратів:
Отримання посівного матеріалу.
Приготування поживного середовища.
Стерилізація поживного середовища.
Очистка повітря до і після стерилізації.
Виробниче культивування.
Одержання продукту.
Бітехнологічне виробництво вітамінів
Біотехнологічно отримують β-каротин, рибофлавін і ціанкобаламін.
При виробництві кормового мікробіологічного білка: 1) додатково отримують ліпіди, в склад яких входять жиророзчинні вітаміни; 2) дріжджі, отримані з гідролізату рослинної сировини опромінюють УФ, при цьому ергостерин перетворюється у ергокальциферол (вітамін D2).
Виробництво β-каротину
Перше промислову виробництво у 1956 році в Швейцарії.
У 1983 році в США (Food and Drug Agency) β-каротин затверджено як біодобавку.
У 2000 році – в 117 країнах світу.
В Україні у 1977 році на Верхньодніпровському крохмально-паточному комбінаті запущено цех по виробництву каротину потужністю 1000 кг в рік (72,5 тон біомаси в рік). Випускають “каротин мікробіологічний”, який містить 180-200 мг% каротину. Продуцент Blakeslea trispora (гриб). Крім каротину в препараті є білок (16-30%) та інші вітаміни.
Продуценти каротину:
Мукоровий гриб Blakeslea trispora (3200 мг на 1 л середовища).
Бактерії Rhodosscudomonas acidophilia (4-6 мг каротиноїдів на 1 л середовища).
Дріжджі (0,3 мг на 1 г сух. реч.)
Міцеліальні гриби (0,25-1,5 мг на 1 г сух. реч.)
Водорості – в Японії і Австралії.
|