Біотехнологія одержання антибіотиків
План
Механізм дії антибіотиків.
Отримання напівсинтетичних пеніцилінів.
Біосинтетичні пеніциліни.
Отримання напівсинтетичних цефалоспоринів та цефаміцинів.
Стійкість мікроорганізмів до антибіотиків.
Отримання кормових антибіотиків.
Механізм дії антибіотиків:
А) Зв’язуються з йонами металів і порушують регуляцію йонної проникності бактеріальних мембран (пептидні). Б) Впливають на транспорт протонів та йонів в мембранах грибів (полієнові).
Блокують роботу окремих ферментів (пеніцилін).
Порушують синтез білка на рівні рибосом (тетрацикліни інгібують зв’язування аміноацил-т-РНК з А-ділянкою 30S-субчастин рибосом; лінкоміцин та хлорамфенікол інгібують утворення пептидного зв’язку і діють на 50S-субодиницю).
Порушують синтез РНК (рафаміцин інгібує ініціацію транскрипції, стептолідигін інгібує елонгацію транскрипції).
Вбудовуються в молекули ДНК (актиноміцин зв’язується з ДНК де є гуанін). Інтеркаляція – вбудовування плоских ароматичних кілець в молекулу ДНК.
Бактеріальні стінки
Муропептид – дисахарид з боковим тетрапептидним ланцюгом.
Муреїн (лат.murus – стінка) – пептидоглікан, який утворюється при зв’язуванні окремих муропептидів. Вуглеводні частини до вуглеводних, пептидні до пептидних.
Муреїн обволікає бактерію виступаючи в ролі бактеріального скелета.
Механізм дії β-лактамних антибіотиків
На зовнішній поверхні бактеріальних оболонок є мембранозв’язуючі ензими (пеніцилзв’язуючі білки). Вони каталізують реакції при яких формуються зв’язки між пептидними ланцюгами муропептидів і утворюється муреїн.
Пеніцилін зв’язується з цими ензимами (структурно подібний до пептидних ланцюгів) і порушує синтез муреїну.
Якщо не утворюється муреїн, то бактерія не може РОСТИ, але не гине від дії антибіотика. Вона гине від старості а нові бактерії не ростуть, бо не можуть сформувати свої стінки. Тому важливо витримати в часі курс антибіотикотерапії, щоб старі бактерії загинули від старості, а молоді не виросли через пригнічення їх росту.
Arsphenamine (1910, торгівельна назва Salvarsan) 606 (606 синтезована речовина для випробувань)
У 1928 році Alexander Fleming зауважив, що плісневий гриб Penicillium notatum викликав лізис колоній золотистого стафілокока (Staphylococcus aureus).
Антибактеріальний ефект проявлявся на збудників скарлатини, пневмонії, гонореї, менінгіту і дифтерії.
У 1940 році Ernst Chain і Howard Florey отримали очищений пеніцилін.
14 березня 1942 року в Оксфорді John Bumstead та Orvan Hess здійснили перше успішне лікування пацієнта використовуючи пеніцилін
19 жовтня 1943 року Albert Schatz в лабораторії Selman Abraham Waksman виділив стрептоміцин
Антибіотики – продукти обміну будь-яких організмів (як правило це мікроорганізми, але можуть бути рослини та тварини) та продукти їх хімічної модифікації, які в низьких концентраціях здатні пригнічувати ріст та розвиток мікроорганізмів (бактерії, нижчі гриби, віруси, простіші) та клітин злоякісних пухлин.
1943 р. 0,5 кг пеніциліну
1945 р. 2310 кг пеніциліну (11 000 $ / кг)
1978 р. 14 800 000 кг антибіотиків (18,45 $ / кг)
Сьогодні відомо близько 6000 антибіотичних речовин. З них близько 100 використовують у медицині, ветеринарній медицині і сільському господарстві.
З часу відкриття перших природних антибіотиків отримали напівсинтетичні антибіотики. Вони за будовою складні і отримувати їх хімічним способом дорожче ніж методом ферментації.
При хімічному синтезі: 1) більший розхід матеріалу; 2) низький вихід продукту; 3) велика кількість реакцій які треба здійснити.
Передумови розробки нових антибіотиків та їх продуцентів:
Бензилпеніцилін необхідно було отримувати у великих кількостях, а для цього потрібні були нові штами-продуценти.
Бензилпеніцилін діяв на грам + бактерії, тому потрібні були антибіотики з широким спектром дії.
Пеніцилін нестабільний у кислому середовищі, тому його не можна було застосовувати per os.
Антибіотики викликають алергічні реакції, тому треба мати ряд засобів з однаковою ефективністю, щоб можна було вибрати.
Бактерії набувають стійкості до антибіотиків.
β-лактамні антибіотики
β-лактамні антибіотики мають β-лактамне кільце.
42% усіх вироблених у світі антибіотиків – пеніциліни.
11% цефалоспорини.
Отримання напівсинтетичних пеніцилінів
В кінці 50-х років ХХ сторіччя отримано 6-амінопеніциланову кислоту (6-АПК) відщепленням її від бензилпеніциліну ензимом пеніцилінацилазою.
Отримана 6-АПК має вільну аміногрупу, що відкрило нові можливості для синтезу нових речовин, що володіють антибіотичною активністю. (За 10 наступних років їх отримали 15 000).
У 1978 році 53% з усіх вироблених (14800000 кг) антибіотиків використали на отримання 6-амінопеніциланової кислоти.
Ферментативний синтез пеніцилінів
Пеніцилінацилаза каталізує утворення 6-АПК і каталізує приєднання до 6-АПК з утворенням нових напівсинтетичних антибіотиків.
Пеніцилін
6-амінопеніциланова кислота
Напівсинтетичні пеніциліни
Переваги напівсинтетичних антибіотиків:
Кислотостійкість (можна застосовувати per os).
Стійкі до дій β-лактамаз (пеніциліназ) мікроорганізмів і як результат здатні проявляти активність по відношенню до стафілококів, що стійкі до природних і деяких напівсинтетичних антибіотиків.
Широкий спектр дії (активні до грам + і грам – мікроорганізмів).
Біосинтетичні пеніциліни
При додаванні в поживне середовище Penicillium notatum попередників бокового ланцюга пеніциліну (карбонових кислот та їх похідних) отримували пеніциліни з введеними в боковий ланцюг цими попередниками. Тобто без ензиму пеніцилінацилази.
Так в кінці 40-х років ХХ сторіччя отримали ряд біосинтетичних пеніцилінів (найкращий з них що переважав природні аналоги – феноксицилін).
Але в такому методі був великий недолік – непередбачувана майбутня модифікація. І тому цей метод далі не розвивали.
Цефалоспорини
В кінці 40-х років в культуральній рідині гриба з роду Cephalosporium виявлений новий β-лактамний антибіотик – цефалоспорин С.
Порівняно з пеніциліном він має переваги: 1) менш токсичний; 2) стійкіший до дії β-лактамаз (цефалоспориназ) які його руйнують; 3) не викликав алергічних реакцій у пацієнтів чутливих до пеніциліну; 4) модифікацію крім бокового ланцюга біля вільної аміногрупи можна було здійснювати і в ланцюзі біля третього вуглецю дигідротіазинового кільця.
Цефаміцини
За будовою подібні до цефалоспоринів.
Біля 7 вуглецю мають додатково метоксигрупу.
Ці антибіотики мають підвищену стійкість до β-лактамаз.
Ферментативний синтез цефалоспоринів
У кінці 70-х – на початку 80-х років ХХ сторіччя відкрили цефалоспоринацилазу. Вона каталізує синтез 7-аміноцефалоспоранової кислоти (7-АЦК) та синтез із неї (7-АЦК) модифікованих цефалоспоринових антибіотиків.
Цефалоспорин
7-аміноцефалоспоранова кислота
Напівсинтетичні цефалоспорини
Ферментативний синтез цефаміцинів
Цефаміцинацилаза каталізує синтез 7-аміноцефаміцинової кислоти (7-АЦМК) та синтез із неї (7-АЦМК) модифікованих цефаміцинових антибіотиків.
Цефаміцин
7-аміноцефаміцинова кислота
Напівсинтетичні цефаміцини
Стійкість мікроорганізмів до антибіотиків
У 1928 році Alexander Fleming зауважив, що плісневий гриб Penicillium notatum викликав лізис колоній золотистого стафілокока (Staphylococcus aureus).
Стафілококи синтезують ензими β-лактамази (зокрема пеніциліназу, цефалоспориназу, цефаміциназу і т. д.) які гідролізують зв’язки між 4 і 7 атомами вуглецю у β-лактамному кільці антибіотиків і тим перетворюють їх у неактивні сполуки.
β-лактамази діють на пеніциліни, цефалоспорини, цефаміцини та усі інші β-лактамні антибіотики.
Вислів “бактерії набувають стійкості до антибіотиків” пояснюється тим, що проходять мутації в геномі бактерій і в них з’являються гени, які кодують β-лактамази, що здатні інактивувати β-лактамні антибіотики.
За даними Всесвітньої організації охорони здоров’я в сільському господарстві менше половини антибіотиків використовують для лікування тварин, а більшість є стимуляторами росту тварин. Це є головною причиною мутацій в геномі бактерій які ведуть до “привикання бактерій до антибіотиків”.
Це є головною причиною мутацій в геномі бактерій які ведуть до “привикання бактерій до антибіотиків”.
Для людей антибіотики використовують лише з лікувальною метою, але людей уражають ті мікроорганізми що і тварин, а стійкість до антибіотиків вони набувають від сільськогосподарських тварин.
Січень 1997 року
Резистентний різновид чотирьох бактерій, що спричиняють захворювання у людей, передалися від тварин людям і становлять небезпеку для здоров'я людей зокрема це: Salmonella, Campylobacter, enterococci, E. Coli
В Європейському Союзі заборонені
1997 рік – авопарцин (avoparcin);
1 липня 1999 стимулятори росту тварин: віргініаміцин (virginiamycin), спіраміцин (spiramycin), тілозін фосфат (tylosin phosphate) та бацитрацин цинк (bacitracin zinc);
Січень 2006 стимулятори росту тварин: монензін натрій (monensin sodium), саліноміцин натрій (salinomycin sodium), авіламіцин (avilamycin) і флавофосфоліпол (flavophospholipol).
Генна інженерія
План
Будова нуклеїнових кислот.
Структура гена еукаріот.
Нуклеотиди:
Основа (пуринова або піримідинова)
Пентоза (дезоксирибоза або рибоза)
Фосфорна кислота (від 1 до 3 залишків)
Нуклеотиди з’єднані естерним зв’язком між фосфатним залишком (знаходиться біля 5’ вуглеця пентози) одного нуклеотида і ОН-групою (знаходиться біля 3’ вуглеця пентози) іншого нуклеотида.
На одному кінці ланцюга є вільна фосфатна група – 5’ кінець, а на іншому кінці ланцюга є вільна ОН-група – 3’ кінець.
Правила Чаргаффа: А – Т; Ц – Г
Транскрипція – синтез РНК “на” ДНК.
Реплікація (редуплікація) ДНК – синтез ДНК “на” ДНК.
Трансляція – синтез поліпептидів “на” м-РНК (і-РНК).
Ген (цистрон) – ділянка ДНК, яка кодує один поліпептидний ланцюг.
Локус – ділянка молекули ДНК на якій знаходяться гени чи регуляторні ділянки.
Кодон – послідовність трьох нуклеотидів. Кожний кодон кодує певну амінокислоту або є сигнальним.
Геном людини складається з 3 000 000 000 пар основ. 20 000-25 000 генів.
Регуляторні гени контролюють транскрипцію.
Структурні гени визначають амінокислотну послідовність білків.
Оперон – ділянка ДНК, яка включає регуляторні та структурні гени.
Промотор – ділянка ДНК з якою зв’язується РНК-полімераза та ініціюється транскрипція (є РНК-полімерази І (А), ІІ (В) та ІІІ (С) – транскрипція генів рРНК, більшості генів та тРНК відповідно). Знаходиться на початку оперона.
Оператор – ділянка ДНК, з якою зв’язується білок репресор в результаті чого блокується транскрипція (якщо репресор не зв’яжеться, то транскрипція відбудеться). Знаходиться після промотора і перед структурними генами. Синтез репресора контролює регуляторний ген, який знаходиться безпосередньо перед опероном, або на певній відстані від нього.
Екзони – ділянки ДНК, які транскрибуються в про-і-РНК та знаходяться в і-РНК.
Інтрони – ділянки ДНК, які транскрибуються в про-і-РНК, але в процесі сплайсингу видаляються і тому відсутні в і-РНК.
Сплайсинг – посттранскрипційна модифікація про-і-РНК, при якій інтрони видаляються, а екзони об’єднуються в і-РНК.
Термінатор – ділянка ДНК, яка відповідає за припинення транскрипції. Знаходиться на кінці транскрипта.
Оперон еукаріот має складний за будовою промотор та екзон-інтронну почерговість структурних генів.
Оперон прокаріот має простіший за будовою промотор та не має інтронів.
ОТРИМАННЯ ГЕНІВ
Трансдукція – перенесення генетичного матеріалу в клітину при допомозі вірусного вектора.
Сайт – нуклеотидна послідовність в нуклеїновій кислоті (ділянка нуклеїнової кислоти).
Праймер – олігорибонуклеотид, який містить від 4 до 10 нуклеотидних залишків.
Праймаза – РНК-полімераза.
Плазміди – подвійні замкнені в кільце спіралі ДНК з одним, або кількома генами (іноді і без генів). Виявлені в бактеріях (цитоплазма), дріжджах та мітохондріях еукаріотичних клітин. Вони функціонують незалежно від решти генетичного матеріалу, переходять з однієї клітини в іншу. Деякі бактеріальні плазміди можуть включатись в геном і знову відділятись.
Епісома – плазміда, яка включається в хромосому клітини і утворює ковалентно-зв’язану структуру.
Бактеріофаги – віруси, які розмножуються в бактеріях.
Вектор – молекула ДНК, яка здатна до автономної реплікації і включення чужорідної ДНК.
Бактеріальні плазміди і епісоми, бактеріофаг λ, деякі онкогенні віруси – це вектори.
Методи отримання генів:
Хімічний синтез генів.
Ферментативний синтез генів.
Виділення генів з природного матеріалу.
Хімічний синтез генів
Суть методу: структуру гена встановлюють на основі розшифрованої первинної структури білка чи РНК які кодуються цим геном.
Вперше у 1969 році в США здійснив індійсько-американський біофізик Hara Corana (народився 9 січня 1922 року у селі Райпура провінція Пенджаб в той час Індія, тепер Пакистан).
Синтезували ген, який кодує структуру аланінової т-РНК пекарських дріжджів:
Встановили послідовність нуклеотидів в гені на основі послідовності нуклеотидів в т-РНК;
Синтезували фрагменти довжиною 4-13 нуклеотидних пар;
З’єднали окремі фрагменти за допомогою Т4-полінуклеотидлігази (виділена з фага Т4);
Отримали ген довжиною 77 нуклеотидних пар, але він був неактивний, бо не мав регуляторних ділянок (промотора і термінатора).
У 1976 році у цій же лабораторії синтезували ген тирозинової т-РНК:
Довжина 126 пар нуклеотидів, сюди входили промотор (52 пари) і термінатор (21 пара).
До кінців гена були прикріплені “липкі” кінці ААТТ і ТТАА.
Цей ген вмонтували в геном бактеріофагу λ і потім ввели в бактеріальну клітину.
Недоліки отримання генів методом хімічного синтезу:
Сам метод трудомісткий;
Розшифровка генів еукаріот ускладнена їх екзон-інтронною будовою.
Великі за розміром гени складно синтезувати.
Ферментативний синтез генів
ДНК
↓
РНК
↓
Білок
|
ДНК
↕
РНК
↓
Білок
|
У 1970 році в онкогенних вірусах відкрили фермент зворотну транскриптазу (ревертазу), за допомогою якого ДНК транскрибується з молекул і-РНК.
У 1972 році (США) отримали ділянку ДНК, що була геном глобіну кроля:
Виділяють молекули і-РНК необхідного гена.
На 3’-кінці така молекула і-РНК має кілька аденілових нуклеотидів. До них приєднують ще кілька таких нуклеотидів.
Вносять “затравки” – олігонуклеотиди тиміну (комплементарні аденіловим), які ініціюють процес утворення пар А-Т.
В середовище вносять дезокситрифосфати (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) та фермент зворотню транскиптазу (виділена з віруса пташиного міобластозу) – проходить зворотне транскрибування.
Після завершення транскрипції ланцюга ДНК на матриці і-РНК, отриманий комплекс ДНК-і-РНК обробляють лугом або РНК-азою, щоб звільнити ланцюг ДНК.
На одному ланцюзі ДНК здійснюють комплементарний синтез другого ланцюга ДНК (процес аналогічний реплікації).
Недоліки ферментативного синтезу генів
Отриманий таким чином ген не є повноцінний, бо не має регуляторних ділянок (промотора і термінатора) та інтронів, оскільки в і-РНК немає інформації про ці частини гена.
Промотор і термінатор синтезують хімічним способом і приєднують до гена.
Щоб в гені були інтрони треба виділити не і-РНК, а про-і-РНК, яка не пройшла сплайсингу і містить інтрони.
Виділення генів з природного матеріалу
Суть методу – з клітин виділяють ДНК і фрагментують її ензимами для виділення генів.
У 1972 році відкрили рестриктази.
Рестрикційні ендонуклеази (рестриктази) – це бактеріальні ензими, які розщеплюють ДНК яка потрапляє в бактеріальну клітину з вірусами (захисна дія). До 1985 року індентифікували 100 рестриктаз, сьогодні – близько 400.
Дію рестриктаз нейтралізують метилази, які метилюють азотисті основи (рестриктази не розщеплюють метильовані сайти).
Рестриктази розщеплюють ДНК з утворенням двох типів кінців:
Рестриктаза E.coRI (виділена з E.coli) специфічна до зв’язків А і Г. Вона розщеплює ДНК на фрагмети з одноланцюговими послідовостями які є “липкими” кінцями.
Рестриктаза HaeIII (виділена з Haemophilus aegypticus) специфічна до зв’язків Г і А. Вона розщеплює ДНК залишаючи “тупі” кінці.
Недоліки методу виділення генів з природного матеріалу:
Важко точно “вирізати” ген з ДНК, тобто залишаються зайві нуклеотиди, які заважають наступному використанню генів, або може бути відсутня необхідна частина гена.
Якщо ген дуже малий, то його складно виділити з отриманої суміші.
Краще застосовувати для генів прокаріот, що не мають екзон-інтронної (в генів еукаріот) будови, яка ускладнює їх дію.
Рекомбінантні ДНК
Рекомбінація – обмін генетичним матеріалом між двома вихідними (батьківськими) молекулами ДНК.
Одержання рекомбінантних ДНК:
Однією рестриктазою розщеплюють ДНК з якої добувають ген (отримують ген з двома липкими кінцями) і ДНК вектора (отримують вутор з двома липкими кінцями).
ДНК-лігазами (які каталізують утворення естерних зв’язків між 3’-ОН-групами і 5’-Р-групами) з’єднують кінці векторної ДНК з кінцями гена. Можна також хімічно синтезувати фрагменти з 6-10 пар основ (лінкери) і ними з’єднати кінці векторної ДНК з кінцями гену.
Вводять таку рекомбінантну ДНК в бактеріальну клітину E.coli, де буде проходити реплікація – відтворення ідентичних рекомбінантних ДНК.
Контролюють експресію необхідних генів.
insulin for diabetics; factor VIII for males suffering from hemophilia A; factor IX for hemophilia B; human growth hormone (GH); erythropoietin (EPO) for treating anemia; three types of interferons; several interleukins; granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) for stimulating the bone marrow after a bone marrow transplant; granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) for stimulating neutrophil production, e.g., after chemotherapy and for mobilizing hematopoietic stem cells from the bone marrow into the blood; tissue plasminogen activator (TPA) for dissolving blood clots; adenosine deaminase (ADA) for treating some forms of severe combined immunodeficiency (SCID); angiostatin and endostatin for trials as anti-cancer drugs; parathyroid hormone; leptin; hepatitis B surface antigen (HBsAg) to vaccinate against the hepatitis B virus; C1 inhibitor (C1INH) used to treat hereditary angioneurotic edema (HANE)
|